분석의 방법 Drosophila 행동

이 실험 절차의 전반적인 목표는 초파리의 운동 감각 및 조정 행동을 조사하는 방법을 시연하는 것입니다. 이는 먼저 크롤링 분석(crawling assay)을 통해 유충의 운동 기능을 평가하고, 링 분석(ring assay)을 통해 성체의 운동 기능을 평가하며, 구애 분석(courtship assay)으로 성체의 조정 및 감각 능력을 평가함으로써 수행됩니다. 궁극적으로, 이러한 일련의 행동 분석 패널은 유전적 요인과 약물 처리와 같은 외부 요인이 활동 및 조정 능력에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 보여줄 수 있습니다.

Intra sophala. 기존의 negative geo axis와 같은 방법들에 비해 이 분석법이 가진 주요 장점은 링 분석법(ring assay)이 처리량이 더 많고 민감도가 더 높다는 것입니다. 이 방법은 운동 능력 결함의 조기 발견과 같이 신경퇴행성 질환 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다.

본 분석법은 저희 연구실의 박사후 연구원인 Jamie Becknell 박사가 시연하겠습니다. 유충 이동성 분석법은 유전적 및 환경적 요인이 운동성에 미치는 영향을 측정하는 데 사용됩니다. 먼저 표준 병에 수컷 10~15마리와 처녀 암컷 10~15마리를 넣어 교배를 준비합니다. 24시간 후, 건강한 성충들이 충분한 양의 알을 낳아 병을 채우게 되며, 이를 통해 해당 개체군의 연령을 24시간으로 일치시킵니다.

성체를 새 병으로 옮기고 이 과정을 반복합니다. 이제 병 내 먹이에서 3령 유충이 관찰될 때까지 병을 배양합니다. 20% sucrose 50~100 mL를 넣고 20분 동안 그대로 둡니다.

유충이 위로 떠오르면, 끝부분을 잘라낸 25 milliliter 혈청학적 피펫을 사용하여 유충을 수집한 뒤 메쉬 바스켓에 넣습니다. 메쉬 바스켓에 담긴 유충을 탈이온수로 2회 세척합니다. 이제 유충을 대상으로 실험을 진행할 수 있습니다.

유충에 약물을 처리하려면, 브러시를 사용하여 원하는 수의 유충을 5% sucrose와 해당 약물이 포함된 용액이 담긴 5 mL 비커로 옮깁니다. 유충이 약물이 포함된 당 용액을 15분 동안 섭취하도록 둔 다음, 메쉬 바스켓을 통해 다시 쏟아내어 헹구고, 운동성에 미치는 약물 효과 측정을 진행합니다. 브러시를 사용하여 개별 유충을 2% agar가 포함된 15 cm 페트리 접시로 옮깁니다.

모눈종이 위에 배치합니다. 이제 데이터를 수집하십시오. 1분 동안 용암이 가로지르는 격자선의 수를 세기만 하면 됩니다.

다음으로, 해부 현미경 하에서 브러시를 사용하여 유충을 희석된 효모 페이스트 용액이 담긴 유리 해부 접시의 웰로 옮기고, 1분 동안 유충의 수축 횟수를 측정합니다. 한 번의 수축은 후단에서 전단으로의 완전한 이동 한 번으로 계산합니다. 원하는 수의 유충이 측정될 때까지 이 과정을 반복합니다.

링 프로토콜(ring protocol)은 성체 동물의 이동 속도를 측정합니다. 가벼운 마취 하에 갓 우화한 성체 수컷 초파리를 수집하여 일반 먹이 또는 약물이 포함된 먹이가 들어 있는 표준 바이알로 옮깁니다. 바이알당 약 25마리의 초파리를 넣습니다. 마취에서 완전히 회복되고 약물 농도가 정상 상태(steady state)에 도달하도록 초파리를 상온에서 2~3일 동안 유지합니다.

그 다음, 마취시키지 않은 파리 약 25마리를 성형 플러그가 있는 폴리스티렌 바이알로 옮기고, 바이알을 하나 이상의 링 장치에 조립합니다. 디지털 카메라를 측면에서 바이알을 촬영할 수 있도록 정렬하는 동안 파리가 15분에서 20분 동안 휴식하게 하며, 타이머를 준비하여 분석에 원하는 시간으로 설정합니다. 일반적으로 분석 수행 시간은 3초입니다.

파리가 흐트러지지 않도록 한 손으로 링 장치를 잡고, 다른 한 손에는 카메라 타이머를 정확하게 잡습니다. 벤치 위에 장치를 세 번 가볍게 두드려 파리를 떨어뜨림과 동시에 카메라의 카운트다운 타이머를 시작합니다. 5~6회 시험이 완료될 때까지 1분 간격으로 이 실험을 반복합니다.

초기 데이터 세트를 수집한 후 폴리스티렌 테스트 바이알을 재사용하지 않는 것이 매우 중요합니다. 사용했던 바이알에 새로운 초파리를 넣으면 새 바이알에 넣었을 때만큼 높이 올라가지 않기 때문입니다. 이미지 뷰어를 사용하여 데이터를 수집하려면 그룹별 평균 높이와 등반 정도를 측정하십시오.

이 분석법에는 분석에 사용할 파리를 수집하기 위해 병 속에서 다량의 자손을 생성하고 있는 준비된 유전적 교배군이 필요합니다. 동물의 주관적 새벽 시간으로부터 몇 시간 이내에, 3~4시간 간격으로 병을 비워 모든 성체를 수집하십시오. 갓 우화한 성적 경험이 없는 수컷과 암컷을 수집하여, 수컷은 먹이가 들어 있는 바이알이나 튜브에 개별적으로 수용하고 암컷은 5~6마리씩 그룹으로 수용하십시오.

유사한 사육 상자 내에, 분석을 위해 동일한 수의 암컷과 수컷이 필요합니다. 수집한 초파리를 5일 동안 격리한 후, 교배 휠에 넣고 분석을 수행할 준비를 합니다. 다음으로, 해부 현미경 하에서 암컷 한 마리와 수컷 한 마리를 교배 휠의 챔버로 조심스럽게 옮깁니다.

쌍을 10분 동안 관찰하거나, 그 시간 내에 성공적으로 교미할 때까지 관찰합니다. 여러 행동 중 각각의 행동이 처음 관찰된 시점을 기록합니다. 수컷이 암컷 쪽으로 처음 몸을 돌린 시점을 기록합니다.

수컷이 다리로 암컷을 처음 터치했을 때, 수컷이 처음으로 날개를 펼치고 진동시켰을 때, 수컷이 처음으로 암컷의 생식기를 핥았을 때를 기록하십시오. 수컷이 처음으로 복부를 몸 아래로 말아 올렸을 때를 기록하십시오. 수컷이 암컷에게 처음으로 마운팅을 시도했을 때를 기록하십시오. 마지막으로, 교미가 일어날 때까지 구애 행동에 참여한 총 시간을 기록하십시오.

야생형 동물의 경우, 이는 거의 항상 5~10분 이내에 발생하며, 세 가지 서로 다른 매개변수로 데이터를 수집합니다. 첫째, 행동 잠복기는 해당 행동이 처음 관찰될 때까지 걸리는 시간입니다. 둘째, 행동 빈도는 해당 행동의 관찰 여부입니다.

셋째, 구애 지수는 동물 실험에서 총 시간 및 교미 전까지 소비된 시간 대비 구애에 사용된 시간의 비율입니다. 근위축성 측삭 경화증과 관련된 F-U-S-T-L-S 유전자에 돌연변이가 있는 경우, 삽입 중심 돌연변이체는 야생형 대조군(왼쪽)의 절반 수준의 기어가는 능력을 보였으며, R 5 21 C 미스센스 돌연변이는 기어가는 속도를 분당 약 1 cm로 떨어뜨렸습니다.

젊은 야생형 성체 초파리를 대상으로 링 테스트를 실시한 결과, 3초 동안 3~5cm를 올라가는 평균 높이를 기록하였습니다. 이 분석에서는 링 분석을 시도하는 동안 1분 간격으로 최대 5회 연속 시험을 수행하였으나 탈감작 현상은 관찰되지 않았습니다. 타이밍과 관련하여 가능한 한 정밀하게 측정하는 것이 중요함을 유념하십시오.

숙달되면, 적절하게 수행할 경우 하나의 유전자형에 대해 10회의 시험을 관찰하는 데 30분에서 40분 정도 소요됩니다. 이 영상을 시청한 후에는 초파리의 구애 행동을 관찰하고 점수를 매기는 방법에 대해서도 충분히 이해하게 될 것입니다.