Microplate 응고 분석을 사용하여 인간의 플라즈마에 반영 V 활동의 측정

다음 절차의 전반적인 목표는 인간 혈장 내 피브린 응고물 형성 과정 중 응고 단백질 인자 V의 활성을 측정하는 마이크로플레이트 분석법을 개발하는 것이었습니다. 손상이 발생하면 혈액 응고 과정이 활성화되어 일련의 자이모젠(Xymogen)에서 프로테아제(protease)로의 전환 반응이 일어나며, 이는 최종적으로 응고 효소인 트롬빈의 생성으로 이어집니다. 트롬빈은 수용성 피브리노겐을 피브린 단량체로 절단하며, 이후 이들이 결합하여 불용성 피브린 응고물을 형성합니다. 정상적인 건강 상태나 손상이 없는 상태에서 혈액은 자유롭게 흐르는 액체 상태를 유지하며, 이때 형성되는 피브린의 양은 분해되거나 파괴되는 피브린의 양과 동일합니다.

하지만 특정 질환 상태에서는 혈액 응고가 과도하면 심장 질환과 뇌졸중으로 이어지며, 반대로 응고가 너무 적으면 혈우병에서 흔히 볼 수 있듯이 출혈 경향으로 이어집니다. Factor V는 혈장 내 단백질로, 활성화된 형태인 factor five A는 프로트롬빈 효소 복합체의 일부로서 피브린 응고 형성 중 트롬빈 생성을 가속화하는 핵심적인 역할을 합니다. 프로트롬빈 복합체는 프로테아제인 factor 10 A, 보조 인자인 factor five A, 표면 지질 및 칼슘의 네 가지 성분으로 구성됩니다. membrane factor five A는 기질인 프로트롬빈에 대한 factor 10 A의 촉매 효율 또는 kcat을 약 3000배 증가시켜, 트롬빈 생성과 피브린 응고 형성을 획기적으로 강화합니다.

마이크로플레이트 플랫폼은 편의성, 시간 비용, 적은 시료 양, 연속 모니터링 및 높은 처리량 덕분에 효소 촉매 반응을 측정하는 데 선호됩니다. 피브린 응고 형성 과정은 마이크로플레이트 리더를 통해 혈장의 빛 흡광도 증가를 측정함으로써 모니터링할 수 있습니다. 이때 혈장은 피브린 응고가 없는 투명한 노란색 상태(최소 흡광도)에서 피브린 응고가 형성된 불투명하고 탁한 상태(최대 흡광도)로 변화합니다. 수동 틸트 튜브 분석법이나 자동 분석기를 이용한 분석법과 같은 기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은 분석 속도가 빠르고 비용이 저렴하며, 시료 요구량이 적고 처리량이 높다는 점입니다.

본 분석법은 의도치 않게 활성화된 응고인자 V(factor five)와 트롬빈에 의해 활성화된 응고인자 V의 활성을 측정하여 전체적인 기능적 활성에 대한 완전한 정량적 평가를 수행합니다. 이 기술의 시연은 연구실의 석사 과정생인 Derek Tilley가 맡았습니다. 혈장 샘플 내 응고인자 V 활성을 측정하기 위해서는, 정의상 mL당 1단위의 응고인자 V 활성을 포함하는 표준물질인 정상 인간 혈장(NHP)을 사용하여, 패널 A의 피브린 응고 형성 시간과 패널 B의 피브린 응고 형성 초기 속도에 대한 응고인자 V 1단계 활성 표준 곡선을 작성해야 합니다. 응고인자 V 결핍 혈장, 정상 인간 혈장, 미지 샘플 혈장 및 트롬보플라스틴을 37°C에서 10분 동안 해동하십시오.

제5인자 결핍 혈장과 트롬보플라스틴을 부드럽게 혼합하여 각각 별도의 플라스틱 세척 트레이로 옮긴 후 얼음 위에서 배양합니다. 정상 인간 혈장과 미지의 샘플 혈장은 부드럽게 혼합한 후 얼음 위에 보관합니다. 제5인자 1단계 활성 표준 곡선 작성을 위한 25 millimolar 증류수 내 염화칼슘은 별도의 세척 트레이에 담아 실온에 보관합니다.

1.5 ml 마이크로 원심분리 튜브를 사용하여 HBS pH 7.4 내에서 정상 인간 혈장을 0, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512배로 2배 연속 희석하여 각각 200 microliters씩 준비하고, 충분히 볼텍싱한 후 얼음 위에서 배양합니다. 정체불명의 혈장 샘플의 경우, 1.5 ml 마이크로 원심분리 튜브를 사용하여 HBS pH 7.4 내에서 정상 인간 혈장과 미지 샘플 혈장을 각각 40배 희석하여 200 microliters씩 준비합니다. 마이크로플레이트 리더의 템플릿 홀더에 5개의 마이크로웰 스트립을 넣습니다.

마이크로플레이트 리더의 전원을 켜고 Softmax Pro 마이크로플레이트 애플리케이션 소프트웨어에 접속합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 모든 샘플 마이크로플레이트 웰에 factor five 결핍 혈장 50 µL를 동시에 첨가합니다. 단일 피펫을 사용하여 준비된 정상 인간 혈장의 10단계 연속 희석액, 정상 인간 혈장의 40배 희석액 및 미지 샘플 혈장을 각각 별도의 마이크로플레이트 웰에 50 µL씩 첨가합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 모든 샘플 웰에 thrombo plasty 50 µL를 첨가합니다. 마이크로플레이트 리더 내에서 25 °C로 1분간 배양하며, 배양 시간 1분 중 15~25초 동안 흔들어 줍니다.

MICROPLATE 리더기와 연결된 컴퓨터를 사용하여 Softmax Pro Microplate 애플리케이션 소프트웨어에 접속합니다. Microplate 리더기의 흡광 파장을 405 nanometers 모드로, 반응 온도를 25 degrees Celsius로 설정하고, calcium chloride 첨가 후 처음 5 seconds 동안 흔들림(shake) 설정을 한 뒤 6 minutes 동안 5 seconds마다 405 nanometers에서 흡광도를 측정하도록 프로그래밍합니다. 이후 계산되는 응고 시간(clot times)에는 5 second의 흔들림 간격이 포함되지 않습니다. 두 개의 멀티 채널 피펫을 동시에 사용하여 시료가 들어 있는 두 개의 마이크로플레이트 스트립에 calcium chloride 50 microliters를 첨가합니다.

15초 동안 대기한 후, 컴퓨터의 Softmax Pro에서 즉시 시작 아이콘을 눌러 분석을 시작합니다. 분석된 각 혈장 샘플에 대해 혈전 형성 시간을 결정하며, 이는 흡광도가 최대 증가량의 절반에 도달하는 데 걸리는 시간(초)으로 정의합니다. 혈전 형성의 초기 속도는 시간 대비 흡광도 증가 곡선의 선형 구간 중 처음 다섯 개의 시점 동안의 흡광도 증가율로 정의합니다.

혈전 형성 정도는 측정 종료 시 혈전 형성 과정 동안 도달한 최대 흡광도와 최소 흡광도의 차이로 정의합니다. Softmax Pro의 시간 대비 흡광도 프로필을 사용하여 정상 인간 혈장 희석 시리즈의 혈전 형성 시간, 초기 속도 및 정도를 결정하십시오. factor V 1단계 활성 표준 곡선을 작성하려면, 40배 희석한 정상 인간 혈장과 미지의 샘플 혈장의 혈전 형성 시간을 사용하여 factor V 1단계 활성 표준 곡선으로부터 mL당 단위로 factor V 활성도를 보간하십시오.

이는 트롬빈에 의한 의도적인 활성화가 없는 응고인자 V의 1단계 활성도를 나타냅니다. 이는 마이크로플레이트 리더를 통해 생성된 응고인자 V 분석 과정에서의 시간에 따른 피브린 응고 형성의 대표적인 예시입니다. 이 프로필은 단일 마이크로플레이트 내에서 32배 희석된 정상 인간 혈장을 사용한 피브린 응고 형성을 나타냅니다.

세로축은 피브린 응고물 형성의 결과로 발생한 405 nanometers에서의 흡광도 변화를 나타냅니다. 응고 형성 시간은 흡광도 대 시간 곡선의 중간 지점인 36.4 seconds로 계산되었습니다. 응고 형성의 초기 속도는 611.88 milli units per minute로 계산되었습니다.

구름 형성 정도는 0.35 단위로 계산되었습니다. factor five 분석법은 초기 속도와 구름 형성 정도를 정확하게 측정합니다. 분석 완료 후 웰을 확인한 결과, 응고 형성이 일어났음을 확인하였습니다.

모든 반응은 거의 동일한 수준의 혈전 형성(CloudFormation)에 도달하였으며, thromboplasty와 염화칼슘 처리 전의 초기 흡광도와 처리 후의 최대 흡광도 사이의 405 nanometers에서의 일반적인 흡광도 변화는 0.35에서 0.45 units 사이였습니다. 정상 인간 혈장에 대한 factor five 1단계 활성의 대표적인 예시, units per mil 단위의 factor five 활성 대비 초 단위의 응고 시간 표준 곡선, 그리고 units per mil 단위의 factor five 활성 대비 milli units per minute 단위의 초기 혈전 형성 속도가 각각 패널 A와 패널 B에 제시되어 있습니다.

제5인자는 일반적으로 트롬빈에 의해 활성화됩니다. 활성화된 보조인자인 제5인자 A를 측정하기 위해, 트롬빈 첨가 및 배양 후 두 번째 분석을 수행하는 것은 혈장 시료의 제5인자 2단계 활성도를 정확하게 측정하는 데 매우 중요하며, 제5인자 2단계 분석을 위해 첨가된 트롬빈으로 의도적인 활성화를 유도합니다. HBS pH 7.4에서 최종 농도가 100 nM인 정제된 트롬빈 200~300 µL를 준비하여 얼음 위에서 배양하십시오. 위에서 준비한 정상인 혈장 및 시료 혈장 120 µL를 2.8 mM이 포함된 HBS pH 7.4 170 µL로 40배에서 100배까지 희석하십시오.

염화 칼슘. 각 샘플에 thrombin 10 µL를 추가하여 최종 농도가 10 nM이 되도록 합니다. Vortex를 사용하여 잘 혼합한 후 37 °C에서 1분 동안 배양합니다. 정상 인간 혈장과 샘플 혈장에 HBS pH 7.4 400 µL를 추가하여 500배로 희석합니다.

SoftMax Pro의 흡광도 대 시간 프로파일을 사용하여 각 샘플 혈장 미지 시료 분석에서 정상 인간 혈장의 응고 시간을 결정하십시오. 500배 희석을 고려하여, 각 샘플의 응고 시간을 응고 시간 대 활성의 factor five 1단계 표준 곡선에 대입해 factor five 2단계 활성을 계산하십시오. 이는 factor five 2단계 활성 또는 thrombin에 의해 의도적으로 활성화된 상태의 활성을 나타냅니다.

총 factor five 활성은 factor five 2단계 활성에서 factor five 1단계 활성을 빼서 계산할 수 있습니다. 혈전 형성 시간의 로그 값 대비 log factor five 활성의 표준 곡선을 사용하여 정상 인간 혈장과 파급성 혈관 내 응고(disseminated intravascular coagulation 또는 DIC) 환자 9명의 혈장에서 factor five 활성을 측정하였습니다. 9명의 DIC 환자 모두 factor five 1단계 활성과 초기 혈전 형성 속도가 평균적으로 각각 54%와 18% 감소한 것으로 나타났습니다. DIC 환자의 factor five 2단계 및 총 활성은 정상 인간 혈장과 비교하여 평균적으로 각각 44%와 42% 감소하였습니다.

제5인자와 DIC 환자의 경우, 섬유소 응고 형성 시간이 연장되고 형성 속도가 감소하는 결과가 나타났습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 본 방법을 연구실에 어떻게 적용할 수 있을지에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. 이 방법은 혈장 내 모든 응고 인자의 활성을 측정하도록 쉽게 조정될 수 있어, 광범위한 연구 및 임상 응용 분야에 적합합니다.

궁극적으로, 이러한 factor V에 관한 정보는 DIC와 같은 혈전성 또는 출혈성 질환의 조기 진단 및 치료를 통해 의료 환경에 긍정적인 영향을 미칠 것입니다.