헤르페스의 연구를위한 예비 신경 세포 문화 시스템은 바이러스 지연 및 재가입을 단순

본 실험의 목적은 단순포진바이러스(herpes simplex virus)의 잠복 및 재활성화를 연구하는 데 일차 신경세포 배양 시스템을 어떻게 활용할 수 있는지 보여주는 것입니다. 이를 위해 먼저 RA 배아에서 상경신경절(superior cervical ganglia) 뉴런을 분리하고, 비신경세포를 제거한 후 해리된 신경절에서 분리한 뉴런을 배양합니다. 그 다음, 용해성 복제 억제제가 존재하는 상태에서 EGFP 바이러스를 사용하여 뉴런을 감염시킴으로써 잠복성 HSV 감염을 유도합니다.

다음 단계는 잠복 감염된 배양 세포의 재활성화를 유도하는 것입니다. 마지막으로, 시간에 따른 EGFP 발현을 모니터링하여 재활성화 효율을 평가합니다. 궁극적으로, 화학적 억제제, RNA 간섭 및 유전자 전달을 이용하여 다양한 신경 신호 전달 경로가 단순포진바이러스의 잠복 및 재활성화를 어떻게 조절하는지 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 숙주 뉴런 내에서 단순 헤르페스 바이러스의 잠복 상태를 조절하는 상호작용을 분자 수준에서 상세히 연구할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 잠복 게놈을 억제하는 신호는 무엇인지, 그리고 분자 수준에서 재활성화는 어떻게 유도되는지와 같이 단순 헤르페스 바이러스 잠복 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 뉴런 내에서 이 방법은 HSV-1 잠복 상태에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

이 방법은 다른 신경영양성 알파 헤르페스 바이러스에도 적용될 수 있습니다. 해당 절차의 시연은 저희 실험실의 대학원생인 marigo, Kochi 및 Julian Kim이 진행하겠습니다. 본 프로토콜에서 사용하는 상경신경절(SCG) 뉴런은 임신한 암컷 쥐의 자궁에서 적출한 E 21 쥐 태아로부터 분리합니다. 해부대에서 가위를 어깨 바로 위의 목 기저부에 대고 머리를 몸통에서 분리하여 각 태아를 안락사시킵니다. 신경절을 노출시키기 위해 23게이지 바늘을 사용하여 머리의 목 부분이 위로 오도록 세 군데에 고정합니다.

먼저 척수를 핀으로 고정합니다. 둘째로, 앞쪽 피부를 코 위로 당겨 핀으로 고정하고, 셋째로 식도와 기관을 목 뒤쪽에서 떨어뜨려 핀으로 고정합니다. 경동맥 분지점을 찾아 상경신경절(SCG)을 확인합니다.

경동맥은 한 쌍으로 이루어진 구조입니다. 목의 양측에 두 개의 분기점이 있으므로, 개체당 두 개의 SCG가 존재합니다. SCG는 분기점 바로 아래에 위치합니다.

양 끝을 사용하여 분지점을 벌려 동맥에서 SCG를 분리합니다. SCG는 분지점을 둘러싸고 있는 불투명한 황색 지방 조직과 비교하여 반투명하고 무색입니다. 신경절을 12 milliliters의 L 15에 넣습니다.

15 mL 원뿔형 튜브에 담아 얼음 위에서 포도당을 첨가한 배지입니다. 배아에서 모든 SCG를 수확하고 부드럽게 끌어낸 후, 신경절을 600 RPM에서 1분 동안 원심분리합니다. 이후 과잉 배지를 제거합니다.

트립신과 콜라게나제가 포함된 1 mL의 L 15 배지에 신경절을 부유시킵니다. 37 °C에서 24분 동안 배양합니다.

8분마다 교반합니다. 다음으로, trypsin을 불활성화하기 위해 10 milliliters의 sea media를 넣고 1분간 원심분리합니다. 600 RPM에서 trypsin collagenase media를 가능한 한 많이 제거하고, 10 milliliters의 C media로 신경절(ganglia)을 세척한 후 600 RPM에서 1분간 원심분리합니다.

이 세척 과정을 한 번 더 반복합니다. 세척액을 제거하고 신경절을 1 mL의 C media에 다시 현탁한 후, 5 mL 주사기에 21 gauge 바늘을 장착하여 최대 15회 왕복하며 분쇄(trituration)합니다. 대부분의 덩어리가 해리될 때까지 23 gauge 바늘을 사용하여 분쇄 과정을 마무리합니다.

분리된 뉴런을 70 micron 나일론 필터로 걸러 50 milliliter 원심분리관에 담아 남아 있는 세포 덩어리를 제거합니다. 필터링된 세포 현탁액에서 10 microliter 분주액을 취해 triam blue와 혼합하여 살아 있는 세포의 수를 결정합니다. hemo cytometer를 사용하여 염료를 능동적으로 배제하는 세포의 수를 측정합니다.

다음으로, 콜라겐과 라미닌이 사전 코팅된 96-well 조직 배양 플레이트의 각 웰에 NGF 50 ng/mL가 포함된 C 배지 100 µL와 생존 세포 5,000~6,000개를 분주합니다. 37 °C에서 하룻밤 동안 배양한 후, 다음 날인 in vitro 1일차(DIV 1)에 뉴런의 부착 상태와 일부 축삭 돌기의 성장을 확인합니다.

웰 내의 C 배지를 50 µL의 신경 기저 배지 또는 NGF, Acho, five fluoro two doxy uridine이 포함된 NBM으로 교체합니다. 세포가 건조해지지 않도록 한 번에 한 행씩 배지를 교체하십시오. 배양물을 37 °C에서 5일 동안 배양합니다.

배양물을 매일 관찰하여 비신경세포의 사멸과 신경세포의 성장을 확인하십시오. 체외 배양 6일 차에 이 절차의 이 부분을 시작하려면, 대부분의 비신경 지지 세포가 제거되었는지 확인하십시오. 모든 과정에서 신경세포에 대한 불필요한 물리적 조작을 최소화하는 것이 매우 중요합니다.

배지를 제거하고 교체할 때는 매우 조심스럽고 천천히 수행해야 하며, 그렇지 않을 경우 발생하는 기계적 스트레스가 뉴런의 생존능력에 영향을 줄 수 있습니다. 각 웰의 기존 배지에 aciclovir 또는 CV를 최종 농도가 100 micromolar가 되도록 첨가합니다. 다음 날 세포에 기계적 힘이 부정적인 영향을 미치지 않도록 CV를 천천히 조심스럽게 첨가하십시오.

DIV 7에, EGF 리포터가 바이러스 용해 단백질 US 11에 융합된 재조합 HSV 1을 감염 다중도(MOI) 1~2 사이로 SCG 배양물에 감염시킵니다. 희석한 바이러스를 웰 내의 기존 배지에 직접 첨가합니다. 모의 감염 대조군과 용해 감염군을 포함하십시오.

CV가 없는 배지에서의 양성 대조군. 37°C에서 2~3시간 동안 감염을 진행합니다. 다음으로, 감염 배지를 NGF와 CV가 포함된 신선한 NBM으로 교체합니다. 감염 배지를 교체할 때 매우 조심스럽게 다루는 것이 중요합니다. 플레이트를 자신 쪽으로 기울여 웰 바닥에서 배지를 천천히 제거하십시오.

그런 다음 피펫 팁을 웰 바닥이 아닌 웰 벽면으로 향하게 하여 배지가 세포 위로 부드럽게 흘러내리도록 합니다. 세포가 건조해지는 것을 방지하기 위해 배지는 한 행씩 차례대로 교체하십시오. HSV one 잠복 상태 유지 능력이 손상되지 않도록 가능한 한 조심스럽게 다루어 배양물을 인큐베이터로 옮깁니다.

배양물을 37°C에서 6일 동안 유지하며, 이 기간 동안 바이러스는 잠복 상태가 됩니다. 이 기간 중 형광 현미경을 사용하여 lytic 복제의 지표인 us 11 EGFP 발현을 모니터링하십시오.

예상대로, 가짜 감염 대조군(mock infected control)에서는 GFP 발현이 나타나지 않아야 합니다. S 11 EGFP는 감염된 시료에서만 검출되어야 합니다. CV 처리를 하지 않은 양성 대조군 웰(well)은 1차 감염과 생산적인 용해 복제가 성공적으로 이루어졌음을 나타냅니다.

DIV 14에서 재활성화를 평가하려면, 이전과 동일하게 CV가 포함된 배지를 CV가 없는 신선한 배지로 조심스럽게 교체하십시오. 피펫 팁을 웰 바닥이 아닌 웰 벽면을 향하게 하여 배지가 세포 위로 부드럽게 흘러내리도록 하십시오. 20 micromolar 농도의 LY 2 9 0 0 4와 같은 약리학적 또는 생물학적 변수를 포함하십시오.

A CV 처리된 잠복 감염 배양액에서는 GFP 발현이 검출되지 않아야 합니다. 세포를 37 °C에서 5~6일 동안 배양하십시오. 형광 현미경을 사용하여 살아있는 배양액을 관찰하며 재활성화가 일어나는 뉴런을 검출하십시오.

재활성화 빈도는 EGFP 양성 뉴런이 포함된 웰의 수를 세어 이를 전체 샘플 웰 수에 대한 비율로 나타내어 계산합니다. 이 그림은 재활성화 유도제로 알려진 trigger statin을 감염된 SCG 배양물에 처리한 사례를 보여줍니다. 약물 처리 후 5일 동안 매일 형광 현미경을 사용하여 재활성화를 모니터링하고 점수를 매겼습니다.

TSA를 사용하면 2일 이내에 최대치의 50%까지 재활성화되며, 5일째에는 60%에 도달합니다. DMSO로 나타낸 기저치 또는 자발적 재활성화는 본 실험의 처리되지 않은 대조군 배양물에서 약 10%이며, 일반적으로 이 in vitro 시스템을 사용할 때 5%에서 20% 사이의 범위를 보입니다. 감염된 SCG 배양물의 후기 단계 또한 LY 2 9 0 0 4로 처리되었습니다.

LY에 의해 재활성화가 유도된 재활성화 배양액을 바이러스 DNA 합성 억제제인 PAA(phosphonoacetic acid) 처리군 및 두 화합물을 함께 처리한 군과 비교하였으며, 그 결과는 여기에 나타나 있습니다. LY 2 9 4 0 0 2로 재활성화를 유도한 배양액에서 PAA에 의해 US 11 EGFP 발현이 저해된 것은 US 11 EGFP 발현이 바이러스 DNA 복제에 의존적임을 나타냅니다. 이 절차를 수행할 때, 스트레스나 기계적 움직임으로 인해 유도되는 자발적 재활성화 증가를 방지하기 위해 무균 조작법에 세심한 주의를 기울이고 CG 배양액을 최대한 조심스럽게 다루는 것이 중요합니다. 배양된 뉴런에 HSV 1 잠복 감염을 확립하는 이 절차 이후에, shRNA 넉다운 및 야생형과 돌연변이 유전자의 이소성 발현 등의 다른 방법들을 수행하여 HSV 1 잠복 및 재활성화를 조절하는 뉴런 기능을 특성화할 수 있습니다.

HSV-1은 BSL 2 안전 수칙이 요구되는 인체 병원균임을 잊지 마십시오. 본 절차를 수행하기 전에 BSL 2 조건에서의 작업 방식에 숙달되어 있어야 합니다. 이 영상을 시청한 후에는 잠복성 HSV-1 감염을 유도하기 위한 SCG 배양법을 확립하고, 뉴런에서 효과적으로 재활성화를 유도하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.