작은 쥐의 Cystometry의 사용 : 방광 Chemosensation의 연구

본 절차의 목적은 화학 화합물이 방광의 저장 및 배뇨 기능에 미치는 영향을 결정하는 것입니다. 이는 먼저 방광에 카테터를 삽입함으로써 수행됩니다. 짧은 회복 기간 후, 카테터를 통해 대조 용액을 30분 동안 주입합니다.

추가로 30분 동안 방광 내압과 배뇨량을 기록하는 동안, 동물에게 관심 화합물을 주입합니다. 최종적으로, 배뇨 빈도 분석을 통해 자극성 화학 물질이 배뇨 패턴에 어떤 영향을 미치는지 결과를 확인할 수 있습니다. 고립된 방광의 수축력을 기록하는 것과 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은, 해당 기관의 기능을 더욱 생리적인 조건에서 연구할 수 있다는 점입니다.

예를 들어, 중추 신경계의 조절 작용은 유지됩니다. 수술 단계에는 실험의 성공을 보장하기 위해 준수해야 할 수많은 기술적 세부 사항과 조작법이 포함되어 있어 학습하기 어렵기 때문에, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 방광에 삽입할 튜브를 준비하려면, 먼저 PE 50 튜브를 원하는 길이로 자르고 메인 카테터 위에 18 gauge 카테터의 작은 흰색 조각을 끼웁니다.

그런 다음 튜브의 한쪽 끝을 가열하여 끝부분에 작은 커프를 만들고, 식염수로 플러싱하여 내부의 공기를 모두 제거합니다. 이제 10~12주령의 암컷 쥐에게 isof fluorine을 투여하여 마취를 유도합니다. 마취 유도 후, isof fluorine의 유지 농도를 설정합니다.

동물을 등으로 눕힌 상태로 배치하고 10 cc 주사기로 만든 작은 마취 마스크를 씌웁니다. 복부를 제모하고 진피를 소독한 후 수술을 진행합니다. 다음 수술 과정은 쥐(rat)와 생쥐(mouse) 모두에게 동일한 방식으로 수행됩니다.

먼저 하복부 정중 절개술을 시행하여 방광을 노출시킵니다. 다음으로 수술에서 가장 중요한 단계가 시작됩니다. 수술용 현미경 하에서, 흡수되지 않는 6-0 단사 봉합사를 사용하여 방광 돔(bladder dome)에 주머니 끈 봉합(purse string suture)을 실시합니다.

다음으로 바늘을 사용하여 퍼스스트링(purse string) 내부에 작은 방광루 형성술을 실시합니다. 이 구멍을 통해 커프가 달린 PE 50 카테터를 삽입합니다. PE 10과 같이 더 얇은 카테터 튜브는 저항이 더 높고 가변적일 수 있으므로 권장되지 않습니다.

외과의사 매듭(surgeon's knot)을 사용하여 튜브 주변의 퍼스 스트링(purse string)을 고정합니다. 그런 다음 커프가 달린 팁이 봉합사 바로 아래에 올 때까지 카테터를 조심스럽게 바깥쪽으로 당깁니다. 누출을 방지하기 위해 18 gauge 카테터 조각을 봉합사 쪽으로 밀어 넣습니다.

카테터와 방광 사이에 누출이 있는지 확인합니다. 생리식염수를 천천히 주입하여 확인하십시오. 누출 부위가 있다면 추가 봉합사를 사용하여 조입니다.

이제 단필라멘트 봉합사를 사용하여 복근을 봉합하되, 절개 부위 상단에 카테터가 통과할 수 있는 통로를 남깁니다. 동물이 튜브를 갉아먹는 것을 방지하기 위해 중공 금속봉을 사용하여 카테터를 견갑간 부위로 터널링합니다. 수술 후 금속봉은 피부 아래와 복근 및 배근 위에 위치시켜야 합니다.

로드(rod)를 동물의 피하를 통해 견갑간 부위까지 밀어 넣습니다. 비흡수성 단사 봉합사로 복근과 피부를 봉합하여 수술을 마무리합니다. 이제 식염수로 플러싱하여 삽입된 카테터의 투과성과 안정성을 확인하는 것이 매우 중요합니다.

주입액은 방광을 통해 나와 요도로 배출되어야 합니다. 진통제를 피하 투여한 후, 카테터의 외부 끝부분을 플라스틱 필름으로 밀봉하고 쥐의 하단 등쪽 피부에 카테터를 고정합니다. 마지막으로, 동물이 30분 동안 회복될 수 있도록 합니다.

사이토메트리(cytometry)를 시작하기 전에 기기가 적절하게 보정되었는지 확인하십시오. 쥐를 디지털 저울 위에 놓인 오일이 담긴 수납 용기 위의 대사 케이지에 넣습니다. 다음 단계는 루어 스터브(lure stub)를 통해 삽입된 카테터를 3방향 콕(three-way tap)에 연결하는 것입니다.

탭은 압력 변환기와 주입 펌프에 연결되어야 합니다. 압력 변환기는 증폭기를 통해 데이터 수집 시스템에 추가로 연결되며, 공개 소프트웨어를 사용하는 컴퓨터가 주입 펌프를 가동하여 방광에 식염수를 주입함으로써 제어 측정을 시작합니다. 30분 동안 대사 케이지를 디지털 저울 위에 매달아 쥐의 배뇨량을 추정합니다.

방광이 채워지고 비워지는 동안 방광 내압을 기록합니다. 다음 단계에서는 30분간의 추가 데이터 수집 과정 동안 약물을 전신적으로 또는 방광 내로 투여할 수 있습니다. 실험이 완료되면 동물을 희생시켜야 합니다.

쥐의 전형적인 압력 추적 곡선을 보면, 액체 주입 중에 방광 내 압력이 특정 임계값에 도달할 때까지 서서히 상승하는 것을 알 수 있습니다. 이후 방광이 수축하고 요도 괄약근이 열리면서 주입된 용액이 요도를 통해 배출됩니다. 이러한 과정을 통해 방광이 비워지게 됩니다.

수축이 멈추고 압력은 다시 기저 수준으로 떨어질 것입니다. 마우스로부터 수집된 데이터에서도 모두 동일한 특징이 나타납니다. 머스타드 오일(mustard oil) 또는 MO의 분자 표적을 식별하기 위해 세포 측정법(cytometry)이 사용되었습니다. MO는 방광과 같은 내장 기관의 염증 및 과민통증 실험 모델에서 오랫동안 사용되어 온 반응성이 매우 높은 화합물입니다.

예상대로, 야생형 마우스에 10 millimolar MO를 방광 내로 주입했을 때 수축 간격의 강한 감소가 유도되었습니다. 흥미롭게도, MO 수용체 TRPA1이 결핍된 마우스는 동일한 조건에서 야생형과 유사한 결과를 보였습니다. 반면, TRPV1 넉아웃 마우스에서는 야생형 마우스보다 MO에 의한 시스템 매개변수의 변화가 훨씬 약하게 나타났으며, TRPA1과 TRPV1이 모두 결핍된 이중 넉아웃 마우스는 MO 투여에 거의 반응하지 않았습니다.

데이터에 따르면 TRP V one이 mo에 의해 유도된 내장 자극에 핵심적인 역할을 할 수 있음을 시사합니다. MO의 방광 내 주입 전과 주입 중의 평균 순간 배뇨 빈도는 이러한 데이터를 뒷받침합니다. 평균 빈도는 생리식염수 주입에 상대적인 값입니다.

이 절차를 수행할 때는 주입액이 복강 내로 누출되지 않도록 카테터가 방광에 단단히 고정되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면 방광 내압 측정 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것이며, 여기에는 카테터의 방광 내 삽입과 조절된 방광 관류 하에서 각성 또는 마취된 동물을 사이토메트리 스테이지에 배치하는 과정이 포함됩니다.