낮은 친화력 세포 수용체 - 리간드 상호 작용의 확장 가능한 감지를위한 욕망 기반의 세포 상호 작용 검사 (AVEXIS)

이 실험 절차의 전반적인 목표는 세포 인식 과정, 특히 막 결합 수용체 단백질과 관련된 새로운 세포 외 단백질 상호작용을 발견하는 것입니다. AveXis 접근 방식은 이 클래스의 단백질 상호작용의 특징인 매우 약한 상호작용 친화도와 막 단백질의 생화학적 조작이 어렵다는 점을 극복하기 위해 설계되었습니다. 이는 먼저 세포 표면 수용체의 세포 외 영역에 대한 재조합 단백질 라이브러리를 구축함으로써 달성됩니다.

이는 수용체의 ecto 도메인 영역을 단량체 biotinylated bait 및 5량체 효소 태그 prey 형태의 가용성 단편으로 생성하도록 발현 플라스미드를 설계함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 상호작용 스크리닝을 위해 단백질을 발현시키고 정규화하는 것입니다. 모든 단백질은 이황화 결합 및 당화와 같은 번역 후 변형이 이루어지도록 포유류 세포에서 생성됩니다.

프로토콜의 중요한 단계는 라이브러리 내의 bait 및 prey 단백질이 모두 임계값 범위 내로 정규화되었는지 확인하는 것입니다. 다음은 새로운 상호작용을 탐색하는 흥미로운 단계입니다. Bait 단백질들을 마이크로타이터 플레이트의 개별 웰에 배열한 후, prey 단백질을 사용하여 상호작용을 조사합니다.

그 다음 세척 단계가 수행됩니다. 마지막 단계는 효소 기질을 첨가하여 미끼 단백질 어레이에 캡처된 프레이(praise)를 검출하는 것입니다. 궁극적으로 VEX 스크리닝 결과는 어떤 세포 표면 수용체가 결합 파트너를 형성할 수 있는지 보여주며, 따라서 세포 간 인식 및 통신 과정에 관여할 수 있음을 나타냅니다.

효모 이중 하이브리드(yeast two hybrid) 방식이나 생화학적 정제와 같은 대중적인 단백질 추출 방법과 비교했을 때, 이 기술의 주요 장점은 세포 외 단백질-단백질 상호작용을 검출하도록 특별히 설계되었다는 점입니다. 특히 막 결합 수용체 단백질 간의 새로운 상호작용을 발견하는 데 매우 적합합니다. 막 단백질은 생화학적 조작이 어렵고, 일반적인 상대 수용체와의 상호작용이 매우 약하기 때문에 다른 기술로는 이러한 상호작용을 검출하기가 어렵습니다.

이 방법은 세포가 서로를 어떻게 인식하고 소통하는지와 관련된 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 분자 수준에서는 난자와 정자의 표면에 표시된 어떤 수용체 단백질들이 서로 결합하는지, 또는 근세포 융합이나 신경능선 형성과 같은 세포 행동에 어떤 수용체-리간드 상호작용이 관여하는지 등 기초 생물학적 과정과 관련된 질문들을 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 이 접근법의 주요 과제는 상호작용 스크리닝을 위한 'bait and pray' 단백질 라이브러리를 구축하는 것입니다.

또한 미끼 단백질(bait protein)과 표적 단백질(prey protein)이 분석에 필요한 임계값 범위 내로 정규화되었는지 확인하는 것이 매우 중요합니다. 이는 위음성과 위양성 빈도를 줄여줍니다. 저는 박사 과정 당시 CD 200 세포 표면 단백질의 결합 파트너를 식별하려 노력하던 중에 이 방법론에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다.

본질적으로 저는 이 특정한 세포 표면 수용체의 결합 패턴이 무엇인지에 대한 질문을 던지고 있었습니다. 오늘날에도 이는 기술적으로 답변하기 어려운 질문으로 남아 있습니다. 하지만 당시 인간 게놈 지도가 거의 완성되어 가고 있었고, 게놈 내의 모든 세포 표면 수용체 목록을 완전히 확보하게 됨에 따라, 이제는 이 수용체 단백질 세트 중에서 기술적으로 상호작용할 수 있는 것이 무엇인지 질문할 수 있다는 점을 깨달았습니다.

이는 답변하기 훨씬 쉬운 질문이며, AveXis는 이를 해결하기 위해 우리가 개발한 방법입니다. 베이트(bait) 및 프리(pre) 발현 벡터 라이브러리가 구축되면, 이를 HEC 2 9 3 E 세포에 트랜스펙션할 준비를 합니다. 효율적인 비오틴화(biotinylation)를 위해 트랜스펙션 전날 50 milliliters의 freestyle 2 9 3 배지에서 250,000 cells per milliliter의 밀도로 세포를 분주하여 시작하십시오. 프리 단백질이 아닌 베이트 단백질을 생산하는 데 사용되는 배지에는 d biotin을 첨가합니다. 모든 플레이어가 준비되면 표준 조건에서 세포를 하룻밤 동안 배양하십시오.

비오틴은 용해도가 낮아 정확한 용액 조제가 어렵기 때문에, 추가 비오틴을 별도로 칭량하여 배지에 첨가한 후 다음 날까지 격렬하게 흔들어 섞어주는 방법을 권장합니다. 배양된 세포 50 milliliters에 적절한 transfection 시약을 사용하여 bait 또는 prey 플라스미드 25 micrograms를 transfection 함으로써 비오틴화된 bait를 생성합니다. 이때 bait construct와 분비형 ELI 단백질 비오틴 리가제(biotin ligase)를 인코딩하는 플라스미드를 10:1 비율로 공동 transfection(cot transfect)하고 수확합니다.

세포를 3000 ×g에서 20분 동안 원심 분리하여 가라앉히고, 이어서 상층액을 0.22 µm 필터로 여과하여 transfection 후 5일째의 배양물을 수집합니다. AveXis의 주요 특징 중 하나는 재조합 단백질이 분비되므로 이를 희석하거나 농축하여 임계 활성 범위 내로 조절할 수 있다는 점입니다. 재조합 단백질의 발현 수준이 최대 4배수(four orders of magnitude)까지 다양하게 나타나는 것을 확인하였으며, 따라서 정규화 단계는 스크리닝 과정 중 위양성 발생 가능성을 줄여줍니다.

베이트의 표준화를 시작하려면, 비결합 상태의 비오틴이 스트렙타비딘 결합 부위에서 비오틴화된 베이트 단백질과 결합 경쟁을 일으키므로 투석을 통해 배지에서 제거해야 합니다. 먼저 베이트를 투석 튜브에 넣습니다. 재조합 단백질의 효과적인 투석을 위해 투석 튜브의 표면적을 충분히 확보하는 것이 중요함을 확인하였습니다. 일반적으로 투석하려는 부피에 실제로 필요한 양보다 2~3배 더 많은 튜브를 사용합니다.

투석을 수행한 후, 24시간 동안 PBS와 같은 적절한 완충액을 사용하여 베이트(bait)를 충분히 투석합니다. 스트렙타비딘-코팅된 마이크로타이터 플레이트의 웰을 BSA가 포함된 PBST로 15분 동안 블로킹하여 ELISA를 시작합니다. 그동안 깨끗한 플레이트에 2% BSA가 포함된 PBST를 사용하여 베이트 단백질의 1:3 희석 시리즈를 4단계로 준비합니다.

15분간의 배양 후, 희석액을 strep TTR 코팅 플레이트로 옮기고 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 1시간 후, 웰을 세척한 다음 각 웰에 2 µg/mL OX 68 100 µL를 첨가합니다. 플레이트를 상온에서 다시 1시간 동안 배양합니다. 두 번째 배양이 끝나면 다시 세척 과정을 거치고 플레이트에 anti-US alkaline phosphatase를 넣습니다.

플레이트를 실온에서 1시간 더 배양합니다. 이제 플레이트를 PBST로 3회 세척한 후, PBS로 최종 세척합니다. 잔류 세제를 제거하기 위해, 1시간 후 di ethanol amine 버퍼에 희석된 1 mg/mL 농도의 substrate 1 0 4를 100 µL 첨가합니다.

실온에서 405 nm의 흡광도를 측정합니다. 서로 다른 네 가지 농도로 희석된 투석된 베이트 상청액 시리즈를 anti-CD4 태그 단클론 항체를 이용한 ELISA로 검출했습니다. 희석하지 않은 발현 베이트 단백질이 스트렙타비딘(strep avidin)이 코팅된 플레이트의 모든 비오틴 결합 부위를 포화시키기에 불충분한 경우, Viva spin concentrator를 사용하여 단백질을 농축하십시오. 그렇지 않은 경우, 2% BSA가 함유된 PBST에서 희석된 농도의 베이트 단백질을 사용하십시오.

이는 분석법의 비오틴 결합 부위를 포화시키기에 충분한 양입니다. 베타-락타마제 효소 활성을 이용하여 전구 단백질이 발현되는 상대적 수치를 정량하십시오. 먼저 PBST 2%BSA 버퍼를 사용하여 파라단백질이 포함된 상층액의 희석 시리즈를 제작하는 것으로 시작하십시오.

그런 다음, 희석액 20 µL를 플레이트에 분주된 nitrous stepin 용액 60 µL에 추가합니다. 즉시 플레이트를 플레이트 리더기로 옮기고, 원심 농축기 또는 2% BSA가 포함된 PBST 희석액을 사용하여 향후 20분 동안 1분 간격으로 485 nm에서의 흡광도를 측정합니다. 샘플의 최종 농도를 설정하여 분석 내의 모든 nitros가 약 7분 만에 가수분해되도록 하며, 이는 분당 약 2 ol nitros turnover에 해당합니다.

PBST로 strep TAVR ENC 코팅 플레이트를 세척하고 페이퍼 타월에 가볍게 두드려 물기를 제거하여 AveXis 스크리닝을 시작합니다. 다음으로, 각 웰에 BSA가 포함된 PBST를 첨가하고 플레이트를 30분 동안 배양합니다. 이는 비특이적 단백질 결합 부위를 차단하기 위한 과정입니다.

각 웰에서 플레이트를 싱크대 위로 가볍게 털어 블로킹 용액을 제거하고, 해당 웰에 정규화된 비오틴화 단량체 미끼(biotinylated monomeric bait) 100 µL를 첨가합니다. 플레이트를 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 플레이트를 다시 털어 미끼 샘플을 제거하고 PBST로 3회 세척합니다.

그런 다음 세 번째 세척 후 가볍게 두드려 말립니다. 이제 각 웰에 정규화된 pentamer prey construct 100 µL를 넣고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 1시간 후, 플레이트를 PBST로 세 번 더 세척하고 마지막으로 PBS로만 세척합니다.

마지막으로, 각 웰에 60 µL의 nitrous seven 용액을 첨가하고 상온에서 2시간 동안 플레이트를 배양하거나, 가급적 4 °C에서 16시간 동안 배양하십시오. 다음 날, 양성 상호작용이 일어난 곳은 붉은색으로 변합니다. 시각적 기록을 위해 플레이트 사진을 촬영한 후, 플레이트 리더를 사용하여 485 nm의 흡광도에서 반응을 정량하십시오.

AveXis 스크리닝 반응 시작 후 약 10분이 지나자, 항체 매개 prey capture 대조군과 양성 대조군 상호작용 모두에서 노란색에서 빨간색으로의 색상 변화가 관찰되었습니다. 이러한 색상 변화는 기질 내 아질산염의 가수분해를 나타냅니다. 일부 양성 상호작용은 이 시간 범위 내에서 관찰 가능하지만, 대부분은 나타나기까지 몇 시간이 소요되었습니다.

일반적으로 약 0.4%에서 0.6%의 양성 hit rate가 관찰되었습니다. 단백질 라이브러리가 준비되면, 이 기술의 스크리닝 단계는 신속하게 수행될 수 있습니다. 상호작용을 확인한 후에는 하루에 최대 12개의 플레이트까지 스크리닝하는 것이 충분히 가능합니다.

가장 중요한 다음 단계는 우선 신선한 독립적 단백질 조제물을 사용하여 상호작용이 반복될 수 있음을 보여주는 것입니다. 둘째로, 상호작용이 베이트-프레이(bait-prey) 방향과 무관한지, 즉 상호 간에 교차적으로 일어나는지 항상 확인합니다. 이를 위해 베이트 벡터 도메인을 프레이 벡터에 클로닝하고, 그 반대 과정도 수행합니다.

반복 및 상호 확인이 가능한 상호작용은 신뢰도가 높은 것으로 간주되며, 항상 양성으로 나타났습니다. 표면 플라스몬 공명(surface plasma resonance)과 같은 다른 기술을 사용하여, 우리는 재확인된 모든 상호작용을 추가로 검증하기 위해 표면 플라스몬 공명을 활용하고자 합니다. 중요한 점은, 이를 통해 정제된 두 성분이 직접 상호작용할 수 있음을 입증할 수 있으며, 결합이 포화 상태에 도달함을 보여줌으로써 결합의 특이성을 증명하는 데에도 사용할 수 있다는 것입니다.