실시간, TCR의 동시 이미징 및 관련 신호 전달 단백질에 대한 TIRF 현미경 기법

이 영상에서는 이중 채널 동시 획득 방식을 이용하여 T-세포 수용체 신호 전달 이벤트를 추적하는 절차를 설명합니다. 전반사 형광 현미경(TIRF microscopy)을 사용하며, 먼저 T-세포에 GFP 태그가 붙은 ZAP 70을 인코딩하는 플라스미드를 형질전환합니다. 지질 고정 펩타이드-MHC 복합체, 접착 분자 및 공자극 분자가 포함된 유리 지지 지질 이중층을 준비합니다.

T-세포 수용체가 펩타이드 MHC 복합체와 결합할 때 ZAP 70이 형질전환된 T 세포를 이중층에 추가합니다. T-세포 수용체와 연관된 CD3 사슬은 SRC 가족 키나아제인 LCK에 의해 인산화되며, 키나아제 ZAP 70이 세포질에서 모집됩니다. 그 후 T-세포 수용체를 형광 표지하고 이미징을 수행하는데, 이때 세포는 커버 글라스보다 굴절률이 낮은 배지에 침전되며 전반사 현상이 일어나는 각도로 레이저 빔을 조사합니다.

이는 유리-물 계면에서 소멸파를 생성하며, 이 파동은 매질 내로 지수함수적으로 감쇠하여 100에서 200 nanometers의 침투 깊이를 갖게 합니다. 따라서 형질막에 있거나 그에 매우 인접한 형광체만이 여기됩니다. 결과 이미지의 분석을 통해 T 세포 수용체 마이크로 클러스터에서 신호 전달이 일어남을 알 수 있습니다.

TIRF 현미경 또는 일반적인 공초점 현미경의 주요 장점은 해상도가 더 뛰어나기 때문에 TCR 마이크로 클러스터와 같은 신호 전달 클러스터나 신호 전달 복합체를 쉽게 시각화할 수 있다는 점입니다. 저희 실험실의 박사후 연구원인 Travis Crites와 Chen이 maxi nucleo affection 기술을 사용하여 일차 마우스 T 세포를 형질전환하는 방법과, 항원을 포함하는 유리 지질 이중층으로 자극한 후 전반사 형광 현미경(TIRF M)을 사용하여 이를 이미징하는 방법을 시연할 것입니다.

이 방법은 T 세포, B 세포, 자연 살해 세포 및 비만 세포를 포함한 다양한 면역 세포의 신호 전달을 연구하는 데 널리 사용되어 왔습니다. 본 방법은 범용성이 넓어 포유류 세포의 대부분의 수용체 시스템, 특히 신호 전달이 클러스터 형태로 일어나는 경우를 연구하는 데 유용합니다. T 세포는 형질전환이 매우 어렵기 때문에 이 방법이 생소한 사용자는 초기에 어려움을 겪을 수 있습니다.

또한 T세포의 생존율과 형질전환 효율, bilar 품질 및 현미경 정렬이 기준치에 도달할 수 있도록 정밀한 조정이 필요합니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 AM maxa mouse T-cell nucleo effector kit를 사용하여 나이브 T세포 또는 인 비트로(in vitro) 활성화된 일차 T세포에 발현 플라스미드와 GFP가 태그된 코딩 신호 분자를 형질전환하는 것입니다. 본 연구에 사용된 모든 T세포는 K의 MHC 분자 IE에서 발견되는 MCC 펩타이드를 인식하는 A-N-D-T-C-R을 발현하였습니다. 여기에 제시된 형질전환 절차는 제조사의 권장 사항에 따라 수행되었습니다.

하지만, transfection 이후 T 세포의 생존능을 높이기 위한 몇 가지 팁을 제시합니다. 생존능과 transfection 효율 모두 naive 세포보다 in vitro 활성화된 T 세포에서 더 높기 때문에, 본 프로토콜에서는 시작 전 in vitro 활성화된 T 세포를 사용합니다. 2 mL 튜브에 키트에 제공된 배지 1.9 mL, 성분 A 20 µL, 성분 B 20 µL, 그리고 fetal bovine serum 100 µL를 혼합하여 각 transfection당 2 mL의 보충된 T-cell medium을 준비하십시오.

12-웰 플레이트의 각 웰에 배지 2 mL를 분주합니다. 배지가 평형 상태에 도달할 수 있도록 플레이트를 37 °C의 습윤 배양기에 최소 1시간 동안 둡니다. 차갑거나 pH 7.2가 아닌 배지에 형질전환된 세포를 재현탁하면 세포 사멸이 일어납니다. 형질전환 혼합물을 준비하려면, 마우스 T-세포 nucleo effector 용액 82 µL와 supplement two 18 µL, 그리고 0.5 µg/µL 이상의 농도로 준비된 엔도톡신 프리 플라스미드 DNA 5 µg을 혼합한 후 가볍게 쳐서 충분히 섞어줍니다.

500만에서 1,000만 개의 세포를 15 milliliter 원심분리관으로 옮긴 후, 상온에서 75 ×g로 5분간 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 진공 흡입기를 사용하여 상층액을 최대한 제거하고, 세포 펠릿을 transfection 혼합액에 부드럽게 재현탁하며, 세포 덩어리가 남지 않을 때까지 세포 펠릿을 3~4회 천천히 흡입합니다. 피펫을 사용하여 현탁액을 인증된 amaxa vete로 조심스럽게 옮기며, 이때 기포가 생기지 않도록 주의합니다.

nucleo effector 장치에서 qve select nuclear effector 프로그램 X 0 0 1을 선택하십시오. vete를 Q vete 홀더에 삽입하고 버튼을 눌러 선택한 프로그램을 적용하십시오. 그 후 vete와 사전 평형화된 배양 배지를 즉시 후드로 옮기십시오.

제공된 플라스틱 피펫을 사용하여, 미리 평형을 맞춘 배지 약 500 µL를 웰에 첨가합니다. 그 다음, 플레이트 내의 배지에 세포 현탁액을 한 방울씩 떨어뜨려 첨가합니다.

GFP 태그 단백질의 낮은 수준의 발현을 유도하고 과발현으로 인한 아티팩트의 발생을 최소화하기 위해 세포를 37 °C에서 4시간 동안 배양합니다. 이 섹션에서는 현미경의 모든 구성 요소의 전원을 켜기 전에, 2채널 동시 이미징을 위한 현미경 정렬 방법을 설명합니다. 컴퓨터와 소프트웨어를 실행하십시오.

그 다음 모든 하드웨어 구성 요소가 소프트웨어에 의해 인식되는지 확인하십시오. 소프트웨어가 오류 메시지 없이 시작되었다면 모든 구성 요소가 감지된 것입니다. sub resolution 1 µL를 희석하십시오.

공국소화 표준으로 사용하기 위해 형광 밝은 다중 형광 마이크로스피어를 2 mL의 PBS에 분산시킵니다. 그런 다음, Lab Tech 8-웰 챔버 커버글라스 시스템의 각 웰에 마이크로스피어 현탁액 0.25 mL를 첨가합니다. 챔버 슬라이드 시스템을 대물렌즈 위의 플랫폼에 놓습니다.

그다음 라이브 미리보기 화면에서 유리 위의 비드 흡착 부위에 초점을 맞춥니다. 왼쪽 창은 GFP가 형질전환된 세포가 관찰되는 채널입니다. 오른쪽 창은 살아있는 세포 이미징 실험 중에 표지된 TCR을 보여줍니다.

XY, Z 광섬유 런치의 Y축 정렬을 사용하여, 레이저 빔이 대물렌즈 밖으로 나와 천장에 투사되도록 빔의 위치를 조정하십시오. 이때 대물렌즈가 유리 평면의 초점이 맞는 위치에 있어야 합니다. 천장에 투사된 빔이 퍼져 보인다면, 빔이 평행하게 정렬되지 않은 것입니다.

실험에 사용할 각 레이저 라인에 대해 완전한 콜리메이션 테스트 콜리메이션을 달성하도록 Z 마이크로미터를 조정하십시오. 그런 다음 레이저 파워 미터를 사용하여 각 채널의 레이저 출력을 20 to 30 µW로 조정하십시오. T 세포는 레이저 방사에 매우 민감하므로 조명은 합계 총 50 µW로 제한됩니다.

다음으로 turf의 각도를 설정합니다. 대물렌즈의 광축과 빔의 각도가 90도에 가까워질 때까지 파이버 런치의 Y 정렬 마이크로미터를 돌려 빔을 천장에서 멀어지게 이동시킵니다.

전반사를 위한 임계각에 도달하면 레이저 광은 더 이상 대물렌즈 밖으로 나오지 않습니다. 터프 정렬(turf alignment)이 이루어졌는지 확인하려면 커버 글라스 평면을 기준으로 초점을 위아래로 조절하십시오. 이때 표면에 흡착된 비드들의 초점이 흐려지면서 많은 비드들이 용액 속에 떠 있는 것이 관찰되는 것을 확인할 수 있습니다. 양호한 터프 정렬을 달성하려면 대물렌즈에 대한 빔의 각도를 증가시켜야 합니다.

빔의 각도가 증가함에 따라 표면 근처에 떠 있는 비드들은 사라지기 시작하고, 계면에 흡착된 비드들의 강도는 증가합니다. 이제 계면에 흡착된 비드들을 초점에서 벗어나게 하면, 용액에 떠 있는 비드들은 더 이상 보이지 않게 됩니다. 이 시점에서 커버슬립에 흡착된 비드들만 초점에 맞을 수 있으므로, 터프(turf)가 적절하게 정렬된 것입니다.

다음으로, 적색 및 녹색 형광 채널의 정렬을 맞추기 위해 비드에 초점을 맞추고 두 채널에서 생성된 이미지의 식별 가능한 특징들의 위치를 비교합니다. 한쪽 카메라 스탠드의 X 및 Y 마이크로미터 나사를 사용하여 비드의 상대적 위치를 최대한 가깝게 맞춥니다. 두 채널 간의 공간적 정렬을 확인하기 위해 두 이미지의 왼쪽 하단 사분면에 있는 밝은 비드를 확인하십시오.

이 특징을 두 이미지 모두에서 동일한 상대적 위치에 맞춥니다. 두 채널 모두에서 이미지를 캡처하고 저장합니다. 이 이미지들은 두 채널을 정렬하기 위한 공국소화 표준으로 사용됩니다.

이러한 정렬의 예시로, 정렬 전의 상태가 여기에 나타나 있습니다. 서브 해상도 비즈의 두 채널 이미지가 중첩된 이 이미지에서 보는 바와 같이, 한 채널이 다른 채널에 대해 회전되어 있습니다. 조정 후의 이미지는 여기에 표시된 것처럼 정렬됩니다.

GFP가 형질전환된 살아있는 세포의 이미지를 비교함으로써 정렬 품질을 추가로 정밀하게 검토할 수 있습니다. 두 채널의 Laila podium이 완벽하게 정렬되어 있는지 확인하십시오. 이는 형광 마이크로비즈를 사용하여 설정한 보정 값을 통해 두 이미지를 정렬한 결과입니다.

현미경 설정이 완료되면, 항원을 제시하는 유리 지지 지질 이중층이 포함된 유동 챔버를 준비하고, 먼저 기질과 상호작용하는 형질전환 T 세포를 시각화하기 위해 turf M을 수행합니다. Ana와 Dustin이 기술한 프로토콜에 따라, Ni-NTA 지질, 접착 분자인 ICAM-1 및 펩타이드 MHC 복합체가 포함된 유리 커버슬립 위에 평면 지질 이중층으로 구성된 유동 챔버를 조립합니다. MCC가 로딩된 IEFK는 히스티딘 태그를 통해 이중층에 통합됩니다.

공동 자극 분자인 CD 80을 도입합니다. GPI 앵커를 사용하여 플로우 셀을 현미경 스테이지 위에 놓고, 텐션 바를 이용해 챔버를 현미경 스테이지의 어댑터 플레이트에 부착하여 고정함으로써 안정화합니다. 다음으로, 온도를 제어하기 위해 제조사에서 제공한 가열 장치를 플로우 셀에 부착합니다.

대물렌즈를 이중층(bilayer) 위에 배치하고 이중층 평면에 초점을 맞춥니다. 대물렌즈와 플로우 셀의 가열을 위해 플로우 셀 및 대물렌즈 히터를 켜서 챔버 온도를 37 °C로 맞춥니다. 4시간 동안 배양한 후, 분리된 T 세포를 15 mL 튜브로 옮기고 80 ×g 속도로 원심분리합니다. 세포를 300 µL의 H-B-S-B-S-A 버퍼에 재현탁합니다. 그런 다음 TCR을 라벨링하기 위해 H 57 FAB(최종 농도 10 µg/mL) 또는 H 57 단쇄 가변 단편(최종 농도 20 µg/mL)을 첨가합니다.

세포를 5 mL 팍스 튜브(fax tube)로 옮깁니다. 다음으로, 1 mL 슬립 팁 시린지를 사용하여 3방향 밸브를 통해 세포를 유량 챔버(flow chamber)에 주입합니다. 듀얼 채널 라이브 획득(dual channel live acquisition)에서 TCR 및 GFP 채널의 라이브 미리보기가 나타나도록 이미징 조건을 설정하고, 형질전환된 세포가 있는 영역을 찾습니다.

TCR과 GFP의 강도 차이로 인해, 두 채널 모두에서 세포를 시각화할 수 있도록 이미지 스케일링을 실시간으로 조정해야 할 수도 있습니다. 여기에서와 같이, 유리 평면의 초점을 위로 올려 측면 막 염색 여부를 확인하여 turf 조명을 확인하십시오. 측면 막의 초점이 잡히지 않는다면 turf 정렬이 양호한 상태입니다.

이 라이브 프리뷰에서는 커버슬립 평면과 커버슬립의 초점을 벗어나 현미경의 turf 정렬 상태를 최적화했을 때 모두 측면 막 염색이 뚜렷하게 나타납니다. 대물렌즈에 대한 레이저 각도가 증가하면 측면 막의 초점이 흐려집니다. 10초 간격으로 개별 이미지와 타임랩스 시퀀스 캡처를 시작하십시오.

세포를 유리 지지체 및 제곱 마이크로미터당 6개의 펩타이드가 로드된 hist-tagged IEFK 분자, 제곱 마이크로미터당 100개의 Alexa 647 접합 hist-tagged ICAM-1 분자, 그리고 제곱 마이크로미터당 100개의 GPI 앵커 CD80 분자가 포함된 INTA 이층막 위에서 5분 동안 배양하였습니다. Alexa 546 접합 H57 FAB 단편을 지속적으로 처리한 상태에서 듀얼 채널 동시 획득 TIRF 현미경 관찰을 수행하였습니다.

TCR을 염색하기 위해, 이층막과 처음 접촉한 후 최대 1시간까지 세포를 이미지화하였습니다. 세포당 ZAP 70 클러스터의 수는 자동 클러스터 계수 소프트웨어를 사용하여 분석하였습니다. 각 사례마다 최소 40개의 세포를 분석하였습니다.

로딩된 펩타이드는 삽입 그림에 표시되어 있습니다. ICAM one은 Alexa 6 4 7이 결합된 His tagged ICAM one이 제곱 마이크로미터당 100개 분자 포함된 이중층 위의 세포를 의미합니다. 그림에 표시된 바와 같이, 프레임당 10초로 촬영된 이 영상에서 볼 수 있듯이 zap 70 의존적 신호 전달은 TCR 마이크로 클러스터에서 발생하며, 오직 작용제 리간드에 반응하여 나타납니다.

작용제 펩타이드에 반응하는 TCR 신호 전달은 ZAP 70을 모집하는 TCR 마이크로 클러스터가 접촉 영역의 주변부에서 지속적으로 생성됨으로써 유지됩니다. 이 영상을 시청한 후에는 맥시맥스 핵 도입 기술을 사용하여 일차 T세포를 형질전환하는 방법과 터프 현미경을 사용하여 TCR 마이크로 클러스터로의 GFPT 신호 분자 모집을 적절하게 이미징하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 숙련되면, 이 기술은 적절히 수행될 경우 7시간 이내에 완료할 수 있습니다.

본 절차를 수행할 때, 일차 세포(primary cells)를 매우 조심스럽게 다루는 것이 중요합니다. 실험의 각 단계에서 세포가 건강할수록 형질전환 효율이 높아지며, 이미지 캡처 시 더 많은 세포를 확보할 수 있습니다. T 세포는 운동성이 매우 높으며, 그 결과 TCR 및 GFP 채널을 순차적으로 이미징하면 TCR 마이크로 클러스터와 세포의 이동으로 인해 두 이미지가 완벽하게 일치하지 않을 수 있습니다.

이 문제를 해결하기 위해, 저희는 이중 채널 동시 획득 터프 현미경(dual channel simultaneous acquisition turf microscope)을 개발하였습니다.