마우스의 중추 신경계에서 줄기 세포 주입의 Multimodal 이미징

이 실험 절차의 전반적인 목적은 마우스 뇌로 이식된 줄기세포의 생체 내(in vivo) 거동에 대한 표준화된 추적 관찰을 수행하는 것입니다. 이를 위해 먼저 EGFP와 루시퍼레이스(luciferase)를 공동 발현하는 골수 유래 기질 세포를 형광 마이크론 크기 산화철 입자(MPIO)로 표지합니다. 두 번째 단계는 MPIO로 표지된 BMC를 마우스 뇌 조직에 적절하게 주입하는 것입니다.

다음으로, 생물발광 이미징(bioluminescence imaging)과 자기공명영상(magnetic resonance imaging)을 사용하여 세포 이식편의 생존 및 국소화를 비침습적으로 추적합니다. 마지막 단계는 사후 조직학적 분석을 통해 인비보(in vivo) 이미징 결과를 검증하는 것입니다. 이러한 방법들은 마우스 뇌로 이식된 줄기세포의 거동에 대한 통찰을 제공할 수 있으며, 모델 생물이나 질병 연구와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.

정맥 및 뇌내 주사는 수행하기 어렵고 동물의 생존에 특정 위험이 따르기 때문에 동물 핸들링 단계를 습득하기 어려우므로, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이 절차를 시작하려면, sub confluent 상태로 성장 중인 세포 배양액에 75 times 10 to the six glacial blue micron sized iron oxide particles를 첨가하십시오. 엔도사이토시스(endocytosis)를 통한 입자 섭취가 가능하도록 16시간 동안 추가로 배양한 후, 남아 있는 입자들을 세척하여 제거하십시오.

세포의 합류도(confluency)를 확보하고 G-B-M-P-I-O의 균질한 분포를 유도하기 위해 세포를 24시간 더 배양합니다. 그 후, EGFP 양성 세포의 총 수 대비 EGFP 양성 및 G-B-M-P-I-O 양성 세포의 비율을 계산하여 형광 현미경으로 입자 섭취 여부를 시각적으로 검증합니다. 다음으로, G-B-M-P-I-O가 표지된 BMSC luciferase EGFP 세포를 10 milliliters로 2회 세척합니다.

PBS로 세포를 처리한 후 trypsin EDTA로 처리하고 이후에 세포를 수확합니다. 그런 다음 세포를 세척하고 PBS에서 최종 농도가 133 × 10⁶ cells/mL가 되도록 재부유합니다. 마지막으로, 이식 전까지 세포를 얼음 위에 보관합니다.

이 절차에서는 ketamine 80 mg/kg과 xylazine 16 mg/kg의 혼합물을 복강 내 주사하여 마우스를 마취합니다. 마우스가 잠들 때까지 5분 동안 기다린 후, 무균 조작이 가능하도록 머리를 삭모합니다. 다음으로 마우스를 정위 고정 틀(stereotactic frame)에 배치하고 알코올로 피부를 소독합니다.

그 후, 탈수를 방지하기 위해 눈에 연고를 도포합니다. 해마를 타겟팅하기 위해 두개골을 노출시키도록 두피 정중앙을 절개합니다. 치과용 드릴 버를 사용하여 두개골의 후방 2mm, 외측 2mm 지점에 구멍을 뚫습니다.

이 단계에서 세포 현탁액을 짧게 볼텍싱한 후, 주사기로 세포 현탁액을 흡입합니다. 이어서 주사 바늘을 경막 아래 2.5 mm 깊이까지 내리고 1분 동안 압력이 평형을 이루도록 기다립니다. 1분 후, 바늘을 경막 아래 2 mm 위치까지 후퇴시킵니다.

그 다음, 자동 미세 주입 펌프를 사용하여 0.70 µL/min의 속도로 세포 현탁액 3 µL를 주입합니다. 주입 후에는 주입된 세포 현탁액의 역류를 방지하기 위해 5분 동안 더 기다립니다. 이어서 바늘을 천천히 제거합니다.

그 후, 피부 경계 부위를 소독하고 피부를 봉합합니다. 탈수를 방지하기 위해 0.9% sodium chloride solution 300 µL를 피하 주사합니다. 마지막으로, 마우스가 마취에서 회복되어 생물 발광 이미징을 수행할 수 있도록 가열 램프 아래에 둡니다.

3% iso-fluorine과 산소 혼합물로 마우스를 마취합니다. 그다음 마우스를 광자 이미저(photon imager)에 배치합니다. iso-fluorine 농도를 1.5%로 조절하여 마취 수준을 낮춥니다. 이어서 d-luciferin을 체중 kg당 150 mg의 용량으로 정맥 주사합니다.

photo vision 소프트웨어를 사용하여 5분 동안 이미지를 획득합니다. 그 후, M three vision 소프트웨어를 사용하여 이미지 프로세싱을 수행하고, 설정된 관심 영역(ROI)을 통해 관찰된 신호를 정량화합니다. 자기공명영상을 촬영하기 위해, 산소와 일산화질소 혼합물에 3% ISO fluorine을 첨가하여 마우스를 마취시킵니다.

그런 다음 마우스를 수평형 9.4 Tesla MR 시스템의 구속 장치에 넣습니다. 이소플루란 농도를 1%로 조정하여 마취 수준을 낮춥니다. 다음으로, 탈수를 방지하기 위해 마우스의 눈에 연고를 바릅니다. 그 후, 직장 프로브를 사용하여 체온을 모니터링합니다.

그다음 마우스 복부 아래에 센서를 배치하여 호흡수를 모니터링합니다. 호흡수는 분당 110 ± 10회로 유지하고, 체온은 37 ± 0.5 °C의 좁은 범위 내에서 일정하게 유지합니다. 이후 마우스 머리 위에 표면 RF 코일을 배치합니다.

마우스를 자석의 중앙에 위치시킵니다. 다음으로 ParaVision 5.1을 실행합니다. 함께 제공된 원고에 따라 시퀀스 매개변수를 설정하십시오. 그런 다음 구체적인 해부학적 정보를 얻기 위해 10장의 관상면 T2 가중 스핀 에코 이미지를 획득합니다.

평면 해상도 70 µm²로 줄기세포 이동을 연구하기 위해 NT two star 가중 그라디언트 에코 영상을 획득합니다. 이 단계에서는 마우스를 희생시켜 뇌를 적출합니다. PBS 내 4% 파라포름알데히드 용액을 사용하여 실온에서 2시간 동안 뇌 조직을 고정합니다.

2시간 후, 4°C에서 다양한 농도의 sucrose 구배에 뇌 조직을 넣어 탈수시킵니다. 다음 날, 액체 질소를 사용하여 뇌 조직을 급속 냉동하고, 절편 제작 전까지 -80°C에서 조직을 보관합니다.

크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 뇌 조직을 10 µm 두께로 절편화합니다. 그 후, 형광 현미경 하에서 염색되지 않은 동결 절편을 스크리닝하여 G-B-M-P-I-O 입자의 청색 형광과 EGFP 발현 세포의 녹색 형광을 확인합니다. 이어서, 염색되지 않은 동결 절편을 스크리닝하여 염증 세포로부터 발생하는 녹색 및 적색 배경 형광을 확인합니다.

설명된 glacial blue MPIO 표지 절차는 BMSC, luciferase EGFP 세포를 매우 효율적으로 표지하며, 이는 형광 현미경으로 쉽게 검증할 수 있습니다. 다음으로, G-B-M-P-I-O로 표지된 BMSC, luciferase EGFP 세포를 마우스의 중추신경계(CNS)에 이식하면, luciferase 활성에 기반한 인비보(in vivo) 생물 발광 이미징을 통해 세포 이식물의 생존 여부를 모니터링할 수 있습니다. 또한, glacial blue MPIO의 철 함량에 기반한 인비보(in vivo) 자기공명영상을 통해 이식된 세포의 정확한 위치를 모니터링할 수 있습니다.

마지막으로, 조직학적 분석을 통해 생체 발광 이미징 및 자기공명 이미징으로 얻은 결과가 검증되었습니다. 이식 후 시간이 경과함에 따라 EGFP 발현이 안정적으로 유지됨으로써 안정적인 생존이 확인되었습니다. 이 기술은 분자 이미징 분야의 연구자들이 다양한 신경퇴행성 질환 동물 모델에서 줄기세포 이식 후의 세포 및 분자적 사건을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

이 영상을 시청한 후, 생체 발광 및 자기공명영상을 이용한 분자 이미징 수행 방법과 사후 조직학적 평가를 통해 인비보(in vivo) 결과를 적절히 검증하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.