연체 동물에서 세포 내 칼슘 농도와 시냅틱 효능의 모니터링 변경

세포 내 칼슘은 시냅스 가소성의 여러 메커니즘에서 중요한 부분인 것으로 시사되어 왔습니다. 이러한 가설들은 칼슘의 변화와 시냅스 효능의 변화를 동시에 모니터링함으로써 검증할 수 있습니다. 본 영상에서는 칼슘 이미징과 세포 내 기록법을 결합하여 이를 수행하는 방법을 설명합니다.

본 실험은 연체동물인 Aplysia Cahora의 신경절을 사용하여 수행됩니다. 이 표본은 크고 식별 가능한 뉴런, Aplysia의 천연 상태인 저온 환경, 그리고 이미징을 용이하게 하는 느린 신호 전달 등의 여러 장점이 있으며, 여기서 시연하는 일반적인 기술들은 다른 시스템에도 쉽게 적용할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 뉴욕시 마운트 사이나이 의과대학의 피시버그 신경과학과 및 프리드먼 뇌 연구소에 있는 엘리자베스 크로퍼 교수 연구실의 콜린 에반스입니다.

오늘 우리는 연체동물인 Aplysia cahora의 구강 신경절에서 세포 내 칼슘 농도 변화와 시냅스 효율의 동시 이미징을 시연하겠습니다. 세포 내 칼슘을 검출하기 위해, 시냅스 전 뉴런에 세포막 투과성 칼슘 지시제 염료인 calcium orange를 주입할 것입니다. 그 후 표본을 현미경 아래로 옮겨 시냅스 전 및 후 뉴런에 날카로운 전극을 삽입합니다.

반복적인 시냅스 전 자극은 시냅스 후 전위 또는 PSP 진폭의 증가로 나타나는 시냅스 후 반응의 강화로 이어집니다. 칼슘 지시 염료의 형광 신호를 측정함으로써 시냅스 전 세포 내 칼슘의 동시적 변화를 검출할 수 있습니다. 먼저 약 150 g인 성체 동물의 체중에 맞추어 등장성 염화마그네슘 용액 75 ml를 주입하여 마취시키고, 마취된 동물을 왁스가 칠해진 접시에 고정합니다. 그런 다음 거즈 포셉과 가위를 사용하여 동물의 발 부분에 절개를 가해 구강질(buccal mass)을 노출시킵니다.

구강 신경절(buccal ganglion)은 구강 질량(buccal mass)의 복측에 위치하며, 서로 연결된 두 개의 반신경절(hemi ganglia)로 구성되어 있습니다. 여기에는 수백 개의 뉴런이 포함되어 있으며, 이들은 다른 신경절의 뉴런들과 함께 동물의 섭식 행동 생성 및 제어에 기여합니다. 미세 가위로 모든 구강 신경을 절단하여 신경절을 조심스럽게 분리한 후 동물로부터 제거하십시오.

그 다음, 분리된 신경절을 인공 해수로 채워진 실 가드(sil guard) 코팅 디쉬 바닥에 핀으로 고정합니다. 신경절은 결합 조직 초(sheath)로 둘러싸여 있으며, 개별 뉴런을 노출시키려면 이 초를 제거해야 합니다. 미세 핀셋과 홍채 가위를 사용하여 매우 주의 깊게 이 초를 잘라냅니다.

뉴런의 손상을 방지하기 위해, 영상 촬영 중 움직임이 발생하면 문제가 될 수 있으므로 핀을 사용하여 신경절 초를 약 15분 동안 고정합니다. 세포 내 기록 및 염료 주입을 위한 정밀 전극을 준비하려면, 마이크로 전극 풀러(micro electrode puller)를 사용하여 모세관 튜브를 뽑아냅니다. 외경이 1mm인 박벽 필라멘트 붕규산 유리(borosilicate glass)를 사용합니다.

기록 전극은 3 M potassium acetate로 채웠을 때 약 10 MΩ의 저항을 가져야 하므로, 이에 맞게 풀러(puller)를 조정하여 D 전극을 제작합니다. 제작된 전극의 뒷부분을 10 mM calcium orange 염료 용액에 담그면 전극 내부의 유리 필라멘트를 따라 모세관 현상이 일어나 염료가 팁 끝까지 빨려 들어갑니다. 그 다음, 원활한 전기적 접촉을 위해 전극을 200 mM potassium chloride로 다시 채웁니다. 전극 특성을 개선하고 기록 전극의 저항을 약 5 MΩ까지 낮추기 위해 자체 제작한 Bela를 사용합니다.

전극을 산화 알루미늄 현탁액 흐름 속에 45도 각도로 유지합니다. 현탁액에 염화 나트륨을 혼합하고 옴미터를 연결하여 전극 저항을 모니터링합니다. 베벨링 공정 중에, 수신된 복절 신경절이 담긴 접시를 전기생리학 장치로 옮기고, 전극으로 뉴런을 찔러 정체를 확인함으로써 관심 뉴런의 위치를 찾습니다.

칼슘 이미징을 위해 뉴런을 준비하려면, 먼저 염료가 채워진 전극을 세포체에 삽입하고 30분 동안 15 nano amp의 과분극 전류 펄스를 가해 염료를 전기천공법으로 주입합니다. D calcium orange가 세포 내로 유입됨에 따라, SOR은 옅은 분홍색을 띠게 됩니다. 그런 다음 기록 전극을 조심스럽게 회수하고, 염료가 뉴런의 미세 돌기까지 확산될 수 있도록 준비물을 최소 30분 동안 그대로 둡니다.

다음으로, 준비된 샘플이 담긴 디쉬를 형광 현미경으로 옮깁니다. 당사는 렌즈를 이동시켜 초점을 맞추고 스테이지는 고정되는 정립 고정 스테이지 현미경에서 10배 NA 0.3 수침 렌즈를 사용합니다. 이러한 방식은 조작기(manipulator)를 장착하는 것을 더 용이하게 합니다.

기록 전극을 위해 적절한 필터 블록을 선택하십시오. SI 3 필터 블록은 calcium orange에 적합한 여기 및 방출 필터를 제공합니다. 중성 밀도 필터와 필드 조리개를 사용하여 카메라 파라미터와 조명 강도를 조정하십시오. 광량이 많을수록 노이즈는 줄어들지만, 시료가 표백될 가능성이 있습니다.

Cool snap CCD 카메라는 약 30 fps의 프레임 속도로 500 x 300 픽셀 영역을 캡처할 수 있으며, 우수한 신호 대 잡음비를 제공합니다. 가능한 한 광원 셔터를 닫아 fil 뉴런에 조사되는 빛을 최소화하십시오. 이미징 소프트웨어에서 관심 영역(ROI)을 선택하십시오.

이 영역들은 소프트웨어가 강도 측정을 수행할 위치를 정의합니다. 일반적으로 시냅스 전 뉴런의 1차, 2차 및 3차 분지를 이미지화합니다. 배경 값을 얻기 위해 difi 뉴런 옆에 추가 ROI를 배치하며, 이 값은 이후 모든 다른 데이터 포인트에서 차감됩니다.

시냅스 전 및 후 뉴런의 세포 내 기록 전극을 사용하여 시냅스 전달을 유도하고 모니터링합니다. 카메라의 프레임 출력 트리거 신호를 사용하여 데이터 획득 소프트웨어를 시작하면 전기생리학 및 이미징 데이터 획득 간의 동기화를 보장할 수 있습니다. 동기화를 보장하는 또 다른 방법은 카메라 포트 내부에 LED를 장착하는 것입니다.

이 LED는 기록 세션 시작 시 잠시 켜져 동기화 마커를 제공합니다. 일반적인 실험 과정에서는 짧은 전류 펄스를 주입하여 시냅스 전 뉴런에서 활동 전위를 유발합니다. 본 예시에서는 특정 가설을 검증하기 위해 스파이크 버스트와 그에 따른 칼슘 신호의 증가를 보여줍니다.

칼슘 신호를 조절하여 시냅스 전달에 미치는 영향을 결정할 수 있습니다. 예를 들어, 칼슘 킬레이터인 EGTA와 같은 약물을 시냅스 전단에 주입하거나 관류 시스템을 통해 처리할 수 있습니다. 데이터 분석은 이미징 소프트웨어에서 텍스트 파일로 내보낸 다음, 전기생리학적 데이터를 수집하는 데 사용된 소프트웨어(본 연구의 경우 Cambridge Electronic Design사의 spike two)로 가져와 수행합니다.

ROI 강도 값과 그에 따른 막 전위 변화를 플롯하기 위해 맞춤 작성된 스크립트를 사용하며, 배경 ROI에서 얻은 배경 신호를 빼고 제시된 식을 통해 상대적 변화를 계산함으로써 칼슘 신호의 변화를 정량화합니다. F zero는 자극 직전의 형광 값이며, F는 자극 중의 형광 값입니다. 여기서는 식별된 뉴런 B 21에서 칼슘 형광의 변화를 이미징한 실험 결과를 보여줍니다.

촬영한 영역은 A에 표시되어 있으며, B 1에서는 B 21에서 스파이크 버스트를 유도하여 B 8에서 postsynaptic potential과 칼슘 신호의 변화를 유도하였습니다. B 2는 칼슘 킬레이터인 EGTA를 주입한 효과를 보여줍니다. B 21에서의 스파이크가 더 이상 광범위한 칼슘 형광 증가를 유도하지 않으며, postsynaptic potential의 진폭이 감소하였습니다.

결론적으로, 본 연구에서는 세포 내 칼슘 농도를 동시에 모니터링하고 시냅스 전달의 효율성을 평가하는 데 사용할 수 있는 기술들을 입증하였습니다. 이러한 기술들은 대부분의 기능적 이미징에 비해 비교적 간단한 장비만 필요하며, 습득하기 쉽고 빠릅니다.