역행 형광 라벨이 확인 된 신경 세포의 표적 세포 외 단일 단위 기록을 허용

이 절차의 전반적인 목표는 비유전적 모델 시스템에서 확인된 신경세포군으로부터 생체 내(in vivo) 단일 단위 반응을 기록하는 것입니다. 이는 먼저 두개골 절개술을 수행하여 관심 뇌 영역을 노출시킴으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 텅스텐 와이어를 사용하여 표적 신경세포가 투사되는 영역에 형광 염료를 배치하는 것입니다.

다음으로 염료가 역행성으로 수송되어 투사 뉴런이 선택적으로 표지됩니다. 마지막 단계는 개별 투사 뉴런의 표지된 축삭으로부터 기록하는 것입니다. 최종적으로, 단일 단위 세포외 기록을 통해 온전한 회로 내의 중추 감각 뉴런이 evo의 감각 자극에 어떻게 반응하는지 보여줍니다.

이 방법은 신경 회로가 시냅스 입력 타이밍의 1ms 미만 차이를 어떻게 감지하는지에 관한 핵심적인 질문들을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 개별 뉴런이나 심지어 축삭, 그리고 유전적 접근이 불가능한 시스템까지 표적으로 삼을 수 있다는 점입니다. 약전어(Weakly electric fish)는 통신과 항해를 위해 전기 신호를 사용합니다.

이들은 시냅스 입력 타이밍의 밀리초 미만 차이를 이용하여 서로 다른 물고기에서 오는 신호를 구분합니다. 연구진은 이들의 전기 감각 회로에 있는 추정 시간 비교 뉴런이 어떻게 그렇게 작은 타이밍 차이를 감지할 수 있는지 연구했습니다. 또한, 이 기술은 시각 및 청각 감각 경로와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.

주변 조직에 조밀하게 얽혀 있는 작은 크기와 세포체의 대부분을 덮고 있는 시냅스 전 말단으로 인해 이 세포들로부터 액체를 추출하는 것은 특히 어렵습니다. 전세포 기록(whole cell recording) 중 세포 내 염료 주입을 통해 인비트로(In vitro)에서 단일 세포를 표지함으로써 해당 축삭으로부터의 표적 기록을 유도할 수 있습니다. 마찬가지로, 세포 외 염료 주입 후의 역행성 수송은 뇌 표면 영역의 투사 뉴런을 선택적으로 표지하는 수단을 제공합니다.

이는 체내 단일 단위 기록(in vivo single unit recordings)을 위한 시각적 안내를 제공하는 데 사용할 수 있습니다. D-코딩 바늘을 준비하려면, 먼저 직경 160 µm의 텅스텐 와이어를 전해 연마하여 바늘 끝의 최종 직경을 5~50 µm로 만듭니다. 그 후, 실험 전날 밤에 10,000 molecular weight dextran이 결합된 2 mM Alexa fluor dye 용액으로 바늘 끝을 코팅하여 전신 마취를 유도합니다.

물고기를 300 mg/L의 MS 222 용액이 포함된 수조수에 넣고, 3 mg/mL의 flail 100 µL를 등쪽 체벽 근육에 주입하여 물고기를 고정시키고 전기적으로 진정시킵니다. 다음으로, 기록 챔버에 수조수를 채우고 물고기의 배측이 아래로 향하게 하여 챔버 중앙의 플랫폼 위에 놓습니다. 그런 다음, 피펫 팁을 물고기의 입에 배치하여 100 mg/L의 폭기된 MS 222 용액을 분당 1~2 mL 속도로 공급합니다.

그 후, 고정봉과 왁스를 사용하여 물고기 몸의 양측을 고정합니다. 안구 혈관의 지속적인 혈류와 정상적인 체색을 확인하여 물고기의 건강 상태를 모니터링합니다. 그런 다음 플랫폼을 수직축을 따라 회전시킵니다.

플랫폼의 한쪽 끝을 조절하여 물고기 머리 등쪽 표면의 한쪽 면은 수면 위로 노출되고, 몸의 나머지 부분은 잠겨 있도록 합니다. 피부의 노출된 부위가 마르는 것을 방지하기 위해 잠기지 않은 피부 부위에 킴와이프(Kim wipe) 조각을 작게 잘라 얹어 둡니다. 이 과정에서 면봉을 사용하여 노출된 머리 표면에 0.4% lidocaine을 도포합니다.

그런 다음 메스 날을 사용하여 6.2 cm 크기의 물고기에서 약 3 mm x 5 mm 크기의 직사각형 피부 조직 조각을 절개합니다. 직사각형의 외측 가장자리는 눈의 중심과 일치해야 합니다. 직사각형의 전측 가장자리는 눈의 바로 후방에 위치해야 하며, 내측 가장자리는 정중선의 바로 외측에 위치해야 합니다.

그 후, 포셉을 사용하여 직사각형 조각을 제거합니다. 두개골을 노출시키기 위해 전방 뇌수막 쪽으로 2.5 mm 크기의 정사각형 부위를 추가로 절개합니다. 메스 날을 사용하여 과도한 조직을 긁어내어 노출된 두개골 표면을 완전히 깨끗하게 정리합니다.

그런 다음 Kim wipe와 강제 공기를 사용하여 표면을 완전히 건조시킵니다. 다음으로, 순간접착제를 사용하여 노출된 두개골의 전내측 부위에 금속 포스트를 접착합니다. 접착제가 완전히 마를 때까지 기다립니다.

0.5 millimeter 직경의 볼 밀 카바이드 팁이 장착된 치과용 드릴을 사용하여 6.2 centimeter 크기 물고기의 두개골에 약 2 millimeter x 4 millimeter 크기의 직사각형을 그립니다. 그 후, 메스와 포셉을 이용해 직사각형의 외곽선을 절개합니다. 그런 다음 두개골을 벗겨냅니다.

뇌를 노출시키기 위해 스프링 가위나 바늘을 사용하여 색소가 있는 경막(dura mater)과 투명한 연막(pia mater)을 모두 절개합니다. 그런 다음 핀셋으로 절개된 부분을 제거하여 전외측핵(anterior extra lateral nucleus)과 후외측핵(posterior extra lateral nucleus)을 노출시킵니다. 이제 미리 준비한 D 코팅 바늘이 장착된 매니퓰레이터를 관심 대상인 축삭이 포함된 표적 영역 위에 배치합니다.

본 사례에서 후외측핵(posterior extra lateral nucleus)에 바늘을 조직 내로 약 25 micrometers 깊이로 빠르게 삽입합니다. 염료가 15 내지 30초 동안 확산된 후, 바늘을 뽑아냅니다. 필요한 경우 새 바늘을 사용하여 이 과정을 반복합니다.

염료가 표적 영역 전체에 분포하도록 각각 다른 위치에 배치하십시오. 그런 다음 hickman's ringer solution으로 공동 내의 과잉 염료를 헹구어 내고, 염료의 흡수 및 이동을 위해 최소 2시간 동안 기다립니다. 관심 있는 축삭을 시각화하려면, 물고기가 들어 있는 기록 챔버를 정립 고정 스테이지 형광 현미경의 대물렌즈 아래에 배치하십시오.

호흡 용액을 신선한 수조수로 교체하고 동일한 유량을 유지하십시오. 그런 다음 접지선의 한쪽 끝을 노출된 뇌강에 넣고 다른 쪽 끝을 기록 헤드 스테이지의 접지에 연결하십시오. 다음으로, 꼬리 기저부 옆에 한 쌍의 기록 전극을 배치하십시오.

그 다음 전극을 차동 증폭기와 기록 장치에 연결합니다. 전기기관 방전 명령(EODC)을 모니터링하기 위해, 저배율에서 관찰한 뇌 영역의 축척 스케치를 준비하며, 이때 표지된 축삭의 정확한 위치를 식별할 수 있도록 주요 혈관을 랜드마크로 포함시킵니다. 먼저 D의 배치를 확인하기 위해, 명시야 조명으로 전체 조직을 관찰하여 방향을 잡습니다.

그런 다음 형광 조명으로 관찰합니다. 후외측핵(posterior extra lateral nucleus)에 확산된 라벨링이 나타나야 합니다. 그 후 고배율에서 혈관을 지표로 삼아 전외측핵(anterior extra lateral nucleus)의 위치를 찾습니다.

외경 1mm, 내경 0.58mm의 붕규산염 모세관 유리와 필라멘트를 사용하여 표면 근처의 표지된 축삭을 찾는 동안 형광등으로 조명합니다. 좁은 샹크의 길이가 5mm이고 팁 직경이 약 1~2.4µm인 기록 전극을 제작합니다.

여과된 hickman's ringer 용액을 전극에 채웁니다. 최종 팁 저항은 16에서 155 mega ohms 범위 내에 있어야 합니다. 전극을 압력 포트가 있는 전극 홀더에 거치합니다.

이를 매니퓰레이터에 장착된 헤드 스테이지에 연결합니다. 그런 다음 헤드 스테이지를 증폭기에 연결합니다. 그림에는 표시되지 않았으나, 아날로그-디지털 획득 장치가 증폭기를 컴퓨터에 연결합니다.

그 후, 전극 라인에 30 millibar의 양압을 가합니다. 조직 표면에서 축삭 방향으로 전극을 천천히 전진시킵니다. 전극이 축삭에 가까워지면, 전극이 축삭 옆에 위치했을 때 양압으로 인해 축삭이 약간이지만 눈에 띄게 움직여야 합니다.

테스트 자극 제시 중의 활동을 기록하십시오. 전기적 아티팩트(artifact)는 기록과 자극이 적절히 이루어지고 있음을 확인시켜 주지만, 활동 전위는 나타나지 않아야 합니다. 전극의 외압을 해제하고 자극 및 기록을 반복하십시오.

그 다음, 가벼운 흡입력을 가하여 축삭이 전극 안으로 들어가게 합니다. 자극과 기록을 다시 반복합니다. 이제 자극에 반응하는 활동 전위가 관찰될 것입니다.

활동 전위가 관찰되면 압력 라인을 닫습니다. 원하는 모든 기록이 완료되면, 물고기가 완전히 마취되도록 탱크의 물을 100 mg/L의 MS 222가 포함된 호흡 용액으로 다시 교체합니다. 물고기를 안락사시키기 전 최소 10분 동안은 EODC가 검출되지 않아야 합니다.

여기에 0.1 millisecond, 6 mV/cm의 단상 대측 양성 횡단 사각 펄스 자극에 의해 유발된 활동 전위의 다섯 가지 샘플 트레이스가 있으며, 여기에는 0 mV/cm 자극으로 동일한 단위를 20회 반복하여 75 millisecond 기록 창 동안 측정한 스파이크 시간을 나타내는 래스터 플롯이 있습니다. 지속 시간의 범위는 오른쪽에 나열되어 있습니다. 여기에 표시된 것은 자극 반복당 스파이크 수로 반응을 정량화한 자극 지속 시간 튜닝 곡선입니다.

본 기술에서 보여주는 수술과 염료 주입은 숙달되어 적절히 수행된다면 1시간 이내에 완료할 수 있으며, 염료 주입 후 2~3시간 뒤부터 기록을 시작할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 수술 후 실험 동물의 건강 상태를 주의 깊게 모니터링하는 것이 중요합니다. 더 깊은 뇌 구조에 있는 뉴런으로부터 기록하기 위해 이광자 이미징과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후에는 확인된 뉴런 집단으로부터 단일 단위 응답을 라벨링하고 기록하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.