파편을 사용하여 풀링된 장면에서 드문 게놈 변종의 탐지

이 절차의 전반적인 목표는 희귀 기능적 변이가 우세하게 나타나는 개체군 내에서 유전자를 식별하는 것입니다. 이는 먼저 DNA 샘플 개체군을 풀링함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 차세대 염기서열 분석 라이브러리를 제작하고 서열을 분석하는 것입니다.

이어서 리드를 참조 서열에 정렬하고 오류 모델을 생성합니다. 마지막 단계는 splinter 알고리즘을 이용한 컴퓨터 분석입니다. 궁극적으로 풀링된 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing)의 splinter 분석은 희귀한 기능적 변이가 다수 포함된 집단 내 유전자를 보여주는 데 사용됩니다. 절차를 시연합니다.

오늘은 제 멘토이자 공동 연구자인 Rob Mitra 교수님 연구실의 대학원생인 Francesco Vilania가 진행하며, 제 연구실의 대학원생인 Enrique Ramos가 함께할 예정입니다. 단일 개체 유전자형 분석과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 사전 정보 없이도 혼합된 DNA 분자 집단 내에서 희귀 서열 변이를 매우 정밀하게 검출할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 대규모 코호트 연구에서 새로운 질병 유발 희귀 변이의 빈도를 결정하는 방법과 같이 유전학 및 유전체학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

최적의 정확도를 얻기 위해서는 모든 스플린터(splinter) 실험에 음성 및 양성 대조군이 반드시 필요합니다. PFU ultra high fidelity DNA polymerase를 사용하여 PCR 반응 혼합물을 준비하십시오. 음성 대조군은 클론화된 벡터 백본(vector backbone)과 같이 유전적 변이가 없는 것으로 알려진 임의의 DNA 서열에서 얻은 PCR 산물입니다.

여기서는 M 13 MP 18 벡터로부터 얻은 1, 934 base pair 앰플리콘이 사용됩니다. 양성 대조군은 전체 집단에 존재하는, 이전에 검증된 시퀀스 변이 세트라면 무엇이든 사용할 수 있습니다. 해당 데이터를 사용할 수 없는 경우, 본 실험실에서는 이 표에 나열된 대로 PGMT easy 벡터에 클로닝된 엔지니어링 시퀀스 혼합물로부터 생성된 331 base per PCR 산물로 구성된 인공 양성 대조군을 설계하였습니다.

이러한 서열들을 조합하여 환자 풀 내 실제 변이들의 다양한 소수 대립유전자 빈도를 모방합니다. 본 비디오에 동반된 서면 프로토콜에서 설명한 대로 샘플의 PCR 증폭을 수행한 후, Kyogen Kayak Quick Column purification 또는 대규모 정제를 위한 진공 매니폴드 장착 96-well 필터 플레이트를 사용하여 각 PCR 생성물에서 과잉 프라이머를 제거합니다. 정제가 완료되면 표준 기술을 사용하여 각 PCR 생성물의 양을 정량합니다.

모든 PCR 산물과 대조군을 분자 수에 따라 정규화하여 하나의 풀(pool)로 합칠 준비를 합니다. 농도 기준으로 풀링하면 큰 산물보다 작은 앰플리콘이 과다하게 포함되는 결과가 나타납니다. 따라서 앰플리콘당 정규화된 분자 수를 풀링하십시오.

피펫팅 중 정확도를 유지할 수 있을 만큼 충분히 큰 임의의 숫자를 선택하십시오. PCR 생성물과 대조군을 준비합니다. 작은 PCR 적용물의 경우 단편화 과정에서 말단 부분의 비율이 높아져 편향이 발생할 가능성이 크므로, PCR 생성물의 라이게이션이 필요합니다.

이러한 이유로, 단편화 전 단계에서 풀 PCR 산물을 거대 코스미드(large con)에 라이게이션합니다. 프로토콜에 기재된 대로 T four Ligase, T four PNK 및 PEG를 사용하여 평활 말단 라이게이션(blunt ended ligation)을 위한 혼합물을 준비합니다. 반응물을 22 °C에서 17시간 동안 배양합니다.

이어서 65°C에서 20분 동안 인큐베이션한 후 4°C로 보관합니다. 그 후, 50 ng의 샘플을 아가로스 겔에 로딩하여 라이게이션 여부를 확인합니다. 라이게이션이 성공하면 해당 레인에 고분자량 밴드가 나타납니다.

샘플의 점도를 낮추기 위해 Qiagen PB Buffer로 10배 희석하여 무작위 초음파 처리 전략을 통한 DNA 단편화 준비를 수행합니다. 그 다음, 24개 샘플용 Diagenode Bioruptor를 사용하여 PCR 산물의 거대한 농축물을 단편화하며, 분당 40초 작동 및 20초 휴식 주기로 25분 동안 고출력으로 초음파 처리합니다. 아가로스 겔에서 DNA 단편화 결과를 확인하고, 본문에 설명된 대로 일루미나 시퀀싱을 진행합니다.

시퀀싱을 시작하려면 리드 정렬을 수행하십시오. 가공되지 않은 시퀀싱 리드 파일을 scarf 형식으로 변환하거나 압축하십시오. 압축은 선택 사항입니다.

관련 정보를 손실하지 않으면서 후속 분석 단계에 필요한 시간과 공간을 절약할 수 있습니다. 포함된 정렬 도구를 사용하여 raw read를 주석이 달린 faster 참조 서열에 정렬하십시오. 표적 영역에 특이적인 항목에는 PCR 반응뿐만 아니라 양성 및 음성 대조군이 포함됩니다.

입력 형식은 scarf 형식 또는 압축 형식이어야 합니다. 다음으로, 본문에 설명된 대로 파일 태깅을 수행합니다. 각 런(run)은 고유한 시퀀싱 오류 프로필을 생성하며, 각 런의 오류를 모델링하여 정확한 변이 호출(variant calling)을 수행하기 위해 이를 특성화해야 합니다.

정렬된 태그 파일로부터 각 풀 샘플 라이브러리에 서열 변이가 발생하는 것으로 알려진 내부 대조군이 포함됩니다. 제공된 도구를 사용하여 음성 대조군 참조 서열로 오류 모델 파일을 생성하며, 모든 음성 대조군 서열을 사용하거나 또는 5' 말단과 3' 말단으로 지정된 일부 서열만 사용할 수 있습니다. 고유 리드(Unique reads)와 의사 카운트(pseudo counts)는 항상 적용되어야 합니다.

해당 툴은 출력 파일 이름 파라미터 뒤에 0, 1 또는 2가 붙은 세 개의 파일을 생성합니다. 이 파일들은 각각 splinter를 이용한 변이 호출(variant calling)을 위한 0차, 1차 및 2차 오차 모델에 해당합니다. 런 오차율 프로파일(run error rate profile)을 시각화할 때는 항상 2차 오차 모델을 사용해야 합니다.

오차 모델 그래프를 그리는 데 사용된 Perl 스크립트를 활용하면 0차 오차 모델 파일에 대한 PDF 오차 플롯을 생성할 수 있습니다. 이 플롯 파일은 런(run)별 특정 오차 추세를 보여주며, 분석을 위한 최대 리드 염기 수를 추론하는 데 활용될 수 있습니다. 다음 섹션에서는 희귀 서열 변이를 검출하기 위해 오차 모델을 사용하여 정렬된 파일에서 splinter를 실행하는 방법을 설명하겠습니다.

분석의 첫 번째 단계는 참조 서열과 오류 모델을 사용하여 정렬된 파일에 대해 splinter를 실행하는 것입니다. 결함이 있는 것으로 판단된 단일 리드 염기는 분석에서 제외할 수 있습니다. P-value 컷오프는 변이 호출 분석의 엄격한 정도를 결정합니다.

최소 컷오프 값을 -1.301로 설정하는 것이 적절합니다. 풀 크기(pool size) 옵션은 실제 풀 내의 단일 대립유전자보다 낮은 빈도를 가진 소수 대립유전자의 잠재적 변동성을 제거함으로써, 알고리즘의 신호 대 잡음 판별력을 최적화합니다. 풀 크기 옵션은 실험에서 분석된 실제 대립유전자 수보다 크면서 가장 가까운 값으로 설정해야 합니다.

낮은 빈도로 검출된 변이는 노이즈로 간주하여 무시됩니다. 모든 파라미터와 파일 이름을 입력한 후 splinter를 실행하십시오. 이 파일은 샘플 전체에서 통계적으로 유의미한 모든 히트(hit)를 반환하며, 변이 유형의 위치에 대한 설명을 포함합니다.

DNA 가닥당 변이 빈도의 P-value 및 DNA 가닥당 총 커버리지입니다. 리스트 바이알은 splinter가 샘플 전반의 커버리지를 정규화하는 데 사용됩니다. 첫 번째 필드는 관심 앰플리콘을 나타내며, 두 번째 필드는 돌연변이가 존재하는 위치를 나타냅니다.

N은 나머지 서열에 돌연변이가 없음을 나타냅니다. 정규화 과정에서는 특정 런(run)에 대한 민감도와 특이도를 극대화하기 위해 양성 대조군을 분석하는 것이 핵심입니다. 이는 초기 컷오프 값인 -1.301만으로는 모든 위양성을 제거하기에 충분하지 않을 가능성이 높기 때문에 중요합니다.

모든 splinter 분석에서는 호출된 각 변이의 실제 P-value가 표시되며, 이는 우선순위로 예측될 수 없었습니다. 하지만 기지의 진양성 염기 위치에 대해 초기 출력 결과에 표시된 가장 덜 엄격한 P-value를 사용하여 전체 분석을 반복할 수 있습니다. 이렇게 하면 진양성보다 일반적으로 훨씬 덜 유의미한 P-value를 갖는 대부분의, 또는 모든 위양성을 제외하면서 모든 진양성을 유지하는 역할을 하게 됩니다.

이 과정을 자동화하려면 cutoff tester 스크립트를 사용할 수 있습니다. cutoff tester 스크립트는 splinter 출력 파일과 정규화에 사용된 것과 동일한 탭 구분 파일 형식의 양성 대조군 히트 목록이 필요합니다. 결과물로 최적의 값에 점진적으로 도달하는 cutoff 목록이 생성됩니다.

마지막 줄은 해당 런(run)의 가장 최적화된 컷오프(cutoff) 값을 나타내며, 따라서 데이터 분석에 사용할 수 있습니다. 최적의 결과는 민감도와 특이도가 모두 1에 도달하는 것입니다. 하지만 이에 도달하지 못한 경우, 통합된 리드 염기(read bases) 수를 변경하여 스플린터 분석(splinter analysis)을 최적화할 수 있습니다.

최종 컷오프는 cutoff cut 스크립트를 사용하여 데이터에 적용할 수 있으며, 이를 통해 최적 컷오프 미만의 히트를 splinter 출력 파일에서 필터링합니다. 이 단계에서는 샘플에 존재하는 snip 및 indel이 포함된 최종 splinter 출력 파일이 생성됩니다. 삽입(insertion)에 대한 출력 결과는 치환(substitution) 또는 결실(deletion)과는 약간 다르다는 점에 유의하십시오.

풀드 샘플(pooled sample) 내 단일 대립유전자의 커버리지에 따른 정확도가 이러한 유형의 플롯으로 시각화됩니다. 정확도는 수신자 조작 특성 곡선(receiver operator curve)의 곡선 아래 면적인 AUC로 추정하며, 무작위 정확도인 0.5부터 완벽한 정확도인 1.0까지의 범위를 가집니다. 이 예시에서는 200, 500, 1,000개의 대립유전자가 포함된 풀(pool) 내 단일 돌연변이 대립유전자의 검출을 위해 대립유전자당 커버리지의 함수로서 AUC를 플롯하였습니다.

여기 삽입, 결실 및 치환의 총합에 따른 UC가 도식화되어 있습니다. 이 오류 플롯은 특정 위치에서 잘못된 염기가 삽입될 확률을 나타냅니다. 오류 프로파일을 보면 낮은 오류율을 보이지만, 시퀀싱 리드의 3' 말단으로 갈수록 증가하는 경향을 나타냅니다.

특히 서로 다른 참조 뉴클레오타이드마다 서로 다른 오류 확률을 보입니다. 이 그래프는 대립유전자당 커버리지가 25배를 초과하는 위치에 대해 대립유전자 빈도를 추정하는 splinter의 정확도를 나타냅니다. 이는 splinter로 추정한 풀드 DNA(pooled DNA) 대립유전자 빈도와 전장 유전체 연관 분석(genome wide association studies) 또는 GWAS 결과로 측정된 대립유전자 수 사이의 비교입니다.

매우 높은 상관관계에서 974명의 개체군을 추출하여 20 kb에 걸쳐 시퀀싱 대상으로 지정하였습니다. 희귀 변이 검출을 위해 Splinter를 적용하였습니다. 표준 프로토콜에 따라, 각 개체는 태그된 변이와 새로운 변이의 유전자형 분석 간의 gwas 일치도를 통해 이전에 유전자형 분석을 수행하였습니다.

풀드 샘플(pooled sample)에서의 콜링 결과는 매우 우수했습니다. 시퀀싱 결과로부터 집단 내에서 드물게 나타나는 두 가지 변이를 포함하여 총 세 가지의 변이가 de novo로 확인되었으며, 이는 개별 파이로 시퀀싱(pyro sequencing)을 통해 검증되었습니다. 파이로 시퀀싱과 풀드 시퀀싱 간의 소수 대립유전자 빈도(minor allele frequencies) 또는 수학적 일치도는 매우 우수했습니다. 풀드 샘플에서 희귀 변이를 찾는 과정을 마친 후, 많은 연구자들은 확인된 변이가 어떠한 기능적 결과(functional consequences)를 초래하는지 알고 싶어 합니다.

따라서 변이의 주석 달기가 개발 이후 프로세스의 다음 단계가 됩니다. 이 기술은 DNA 시퀀싱 분야의 연구자들이 대규모 인구 집단 연구에서 희귀 변이의 특성을 규명하기 위해, 신속하고 비용 효율적인 방식으로 희귀 변이를 연구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, splinter를 사용하여 풀(pool) DNA 샘플에서 희귀 서열 변이를 검출하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.