Hematologic 질환의 Microvascular 상호 작용 유학을위한 Endothelialized Microfluidics

본 절차의 전반적인 목표는 내피세포가 코팅된 미세유체 장치를 제작하는 것입니다. 이는 먼저 미세유체 몰드를 제작함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 PDMS 채널을 만드는 것입니다.

다음으로, 내피세포를 장치 내에 파종합니다. 마지막 단계는 장치 내에서 세포를 배양하는 것입니다. 궁극적으로, 내피세포가 코팅된 미세유체 장치는 인비트로(in vitro) 환경에서 세포 간 상호작용을 보여주는 데 사용됩니다.

기존 방법들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 연구자가 생물학적 및 생물물리학적 조건을 정밀하게 제어할 수 있으며 형광 현미경과 호환된다는 점입니다. 이 방법은 혈액 질환에서의 생물물리학적 세포 간 상호작용에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 백혈구 생물학, 암 전이 및 조혈모세포 생물학 등의 현상에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자의 경우, 성공적인 세포 안착을 위해 조건을 매우 정밀하게 제어해야 하므로 어려움을 겪을 수 있습니다.

제작 준비 단계에서 마이크로 유체 장치의 컴퓨터 보조 설계(CAD) 이미지를 외부 마스크 업체에 제출하여 포토마스크를 제작합니다. 수령한 마스크는 소다석회 유리에 크롬 층이 증착된 형태로 구성됩니다. 여기서 마이크로 유체 채널의 너비는 30 microns입니다.

미세유체 장치 제작을 시작하려면, 베어 실리콘 웨이퍼를 piranha 용액으로 15분 동안 세척한 후, 탈이온수로 10초 동안 헹굽니다. 그다음 실리콘 웨이퍼를 불산(hydrofluoric acid)에 30초 동안 담근 후, 탈이온수로 약 10초 동안 헹굽니다. 이어서 스핀 코터를 사용하여 micro chem SU 8 20 25 포토레지스트를 3000 rpm의 회전 속도로 웨이퍼 위에 30 µm 두께가 되도록 스핀 코팅합니다.

과잉 용매를 제거하기 위해 SU 8 20 25이 코팅된 웨이퍼를 95 °C로 설정된 핫플레이트 위에 5분 동안 올려둡니다. 이 단계에서는 오븐 사용을 권장하지 않습니다. 이제 웨이퍼 위에 포토마스크를 배치하고 마스크 라이너에서 UV 광선에 노출시켜 SU 8 20 25 포토레지스트를 가교 결합시킵니다.

가교 결합 후, 웨이퍼를 95 °C의 핫플레이트 위에 다시 올려 5분 동안 더 가열합니다. 이는 SU-8 2025 포토레지스트의 중합 반응을 더욱 촉진하기 위함입니다. 그 다음, 주로 PGMEA로 구성된 SU-8 현상액에 웨이퍼를 4분 동안 담급니다.

이 과정을 통해 가교되지 않은 SU 8 20 25 감광액이 제거됩니다. 새로 현상된 웨이퍼를 100% isopropyl alcohol로 10초 동안 헹군 다음, 가압 질소를 사용하거나 깨끗한 흄 후드 내에서 수분 동안 용매를 증발시켜 건조합니다. 이제 건조된 웨이퍼를 페트리 접시 중앙에 테이프로 고정하되, 테이프가 웨이퍼의 가장자리에 위치하도록 주의하십시오.

마지막으로, 웨이퍼 위에 sigma coat 500 µL를 피펫으로 분주합니다. 페트리 접시의 뚜껑을 덮은 후, 접시를 흔들어 웨이퍼가 완전히 코팅되도록 합니다. 뚜껑을 열고 모든 용매가 증발할 때까지 웨이퍼를 수 분 동안 건조시킵니다.

PDMS 폴리머와 경화제를 10:1 중량비로 혼합한 후, 사용 가능한 진공 시스템의 강도에 따라 수 분에서 1시간 동안 진공 데시케이터를 사용하여 기포를 제거합니다. 모든 기포가 제거되면, 웨이퍼와 디쉬 표면이 덮이도록 혼합물을 디쉬에 붓습니다. 이를 통해 두께가 약 5 mm인 PDMS 시트를 제작합니다.

또한 두께 1 mm의 특징 없는 얇은 PDMS 조각을 제작하십시오. 그다음 60 °C 오븐에서 혼합물을 하룻밤 동안 경화시킵니다. 다음 날, 칼이나 메스를 사용하여 웨이퍼 주변을 절단하고 여러 개의 PDMS 미세유체 장치를 분리합니다.

그런 다음 시트를 잘라 개별 장치를 분리합니다. PDMS 시트를 미세유체 장치보다 약간 더 크게 자릅니다. 이제 핀 바이스 Harris unicorn 또는 이와 유사한 장치를 사용하여 미세유체 장치에 입구와 출구 구멍을 만듭니다.

다음으로, 스카치테이프를 사용하여 미세유체 장치와 시트의 표면을 세척합니다. 그런 다음 플라즈마 세척기를 사용하여 미세유체 장치와 PDMS 시트의 표면을 30초 동안 산소 플라즈마에 노출시킵니다. 산소 플라즈마는 PDMS의 노출된 표면에 반응성 종을 생성하며, 이는 물리적으로 접촉했을 때 결합하게 됩니다.

다음으로, 20게이지 둔탁한 바늘이 장착된 1밀리리터 주사기에 PBS에 희석된 50 µg/mL 농도의 human plasma 유래 Fibronectin을 채운 후 바늘 위에 적당한 길이의 튜브를 끼웁니다. 첫 번째 튜브 안으로 더 얇은 튜브를 삽입하여 두 튜브 사이에 마찰 맞춤(friction fit) 상태가 되도록 합니다.

그 다음 더 가는 튜브의 다른 쪽 끝을 미세유체 장치의 입구에 연결합니다. 시린지에 압력을 가하여 채널을 fibronectin 용액으로 완전히 채우고, 채널이 마르지 않도록 배출구 포트에 100 µL의 작은 방울을 형성합니다. 이제 미세유체 장치를 37 °C의 가습 인큐베이터에서 40~60분 동안 배양합니다.

배양 후, PBS가 채워진 새 주사기를 뭉툭한 바늘(blunt point needle)에 연결합니다. 압력을 가하여 미세유체 장치를 PBS로 세척합니다. 8% dextran이 포함된 혈관 내피 성장 배지에서 밀리리터당 500,000개에서 200만 개의 인간 제대정맥 내피세포(hve)를 준비합니다.

덱스트란을 첨가하면 세포가 미세유체 장치 내에서 성공적으로 부착 및 배양될 가능성이 높아집니다. 둔탁한 끝바늘(blunt point needle)과 더 넓은 튜브가 장착된 깨끗한 시린지에 세포 현탁액을 채우고, 약 1m 길이의 더 긴 튜브를 연결합니다. 모든 연결 부위에서 누수가 발생하지 않도록 튜브가 단단히 밀착되었는지 확인하는 것이 매우 중요합니다.

시스템의 성능을 최적화하기 위해, 시린지나 튜빙 어디에도 기포가 없도록 세포 용액으로 튜빙을 프라이밍하십시오. 이 단계에서 시스템으로 용액이 새거나 기포가 유입되지 않도록 하는 것이 매우 중요합니다. 용액의 누출이나 배지 내 기포의 존재는 혈관 내피세포의 성공적인 안착을 방해합니다.

모든 기포가 제거되고 튜브 전체 길이에 세포 현탁액이 채워지면, 시린지를 펌프에 장착하고 반대쪽 끝을 미세유체 입구에 연결합니다. 시린지 펌프는 미세유체 장치와 동일한 높이로 설정합니다. 긴 튜브는 세포와 배지가 장치에 닿기 전 충분히 가온될 수 있도록 인큐베이터 내에 조심스럽게 말아서 배치합니다.

그런 다음 본 시스템에서 세포 현탁액을 37 °C, 5% carbon dioxide 조건 하에 1.23 µL/min의 부피 유량으로 2시간 동안 미세유체 장치에 주입합니다. 1.23 µL/min의 부피 유량은 가장 작은 채널 내에서 1 mm/s의 중심 유속에 해당합니다. 이는 전혈을 사용할 때 해당 채널 내에서 약 1 dyne/cm²의 벽 전단 응력과 유사합니다.

세포 현탁액 주입이 완료되면, 동일한 시린지 펌프와 긴 튜브에 더 큰 시린지를 사용하여 1.23 µL/min의 속도로 2~8일 동안 신선한 성장 배지를 주입합니다. 세포 단층이 원하는 수준의 합류도(confluence)에 도달하면, 실험을 위해 혈액 또는 세포 현탁액을 시스템에 주입합니다. 여기에서는 내피세포화 전의 미세유체 소자가 표시되어 있습니다.

혈관 생리학을 모방한 장치의 크기, 규모 및 전체적인 설계를 보여주기 위해 미세유체 장치에 식용 색소를 주입하였습니다. 명시야 현미경 관찰 결과 미세유체 장치의 내피세포화가 확인되었습니다. 이 이미지는 기술된 프로토콜에 따라 세포를 파종한 후 48시간 이내에 획득한 것으로, 최적화된 관류 기술을 통해 내피세포가 미세유체 시스템의 전체 내부 표면에서 합류성(confluently) 있게 배양될 수 있었습니다.

세포 파종 후 24~48시간 이내에 진행합니다. 이 공초점 이미지에서 볼 수 있듯이, 미세 채널이 포함된 칩 위의 미세혈관 종양은 대부분의 낫적혈구 질환 미세혈관 폐쇄 사건이 발생하는 부위인 모세혈관 후 정맥의 크기인 30 micron과 유사합니다. 본 실험에서는 건강한 환자의 전혈을 탈산소 조건에서 칩 위의 미세혈관 장치로 주입합니다.

이 영상은 당사의 내피세포 미세유체 시스템 내 전혈의 흐름이 마이크로채널의 폐쇄 구역 없이 규칙적이고 부드럽게 지속됨을 보여줍니다. 여기서는 낫형 세포 빈혈 환자의 전혈을 칩 상의 미세혈관 장치에 주입합니다. 탈산소 조건에서는 여러 채널에서 완전한 폐쇄가 나타나며 혈류의 상당한 변화가 관찰됩니다.

이 절차를 수행할 때, 튜브를 교체하는 과정에서 기포가 유입되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 완성된 장치는 형광 현미경과 호환되며 전통적인 형광 분석법에 맞게 조정하여 사용할 수 있습니다. 이 기술은 실험 혈액학자들이 제어된 생물물리학적 및 혈역학적 환경에서 단일 세포를 이용해 실험을 수행할 수 있는 길을 열어줍니다.

기포가 없어야 합니다.