물에 Supramolecular 폴리머의 크기, 모양과 안정성을 제어

다음 실험의 전반적인 목표는 수중에서 초분자 동적 나노입자의 크기, 모양 및 안정성을 제어하는 것입니다. 이는 인력 및 척력 상호작용이 모두 가능하도록 분자 구조가 코팅된 자기 조립 또는 중합 디코틱 증폭기를 설계함으로써 달성됩니다. 이는 좌절된 성장 메커니즘(frustrated growth mechanism)으로 이어져, 제어된 구형 모양을 가진 수중 자기 조립 나노입자를 생성합니다.

두 번째 단계로, 수용액의 염 농도를 높여 디스코 암피(disco amphi)의 분자 구조에 내재된 반발 상호작용을 약화시킵니다. 이는 구형에서 막대형으로의 전이(sphere to rod transition)를 유도하며, 이러한 전이의 기저 메커니즘을 밝히기 위해 온도 의존적 원편광 이색성(circular dichroism, CD) 분광 분석을 수행합니다. 또한, 저온 투과 전자 현미경(cryogenic transmission electron microscopy)과 핵자기 공명(nuclear magnetic resonance)과 같은 분석 기술을 결합하여 한 종류의 응집체에서 다른 종류로의 전이를 측정하고 시각화하며, 그 결과 구형에서 막대형으로의 전이가 초분자 중합(super molecular polymerization)에서 강화된 협동성으로 나타남을 확인합니다.

이는 제한된 크기의 나노입자 내 반협동적 과정에서, 매우 거대한 초분자 폴리머(이 경우 동적 나노로드)로 이어지는 완전 협동적 핵 생성 신장 메커니즘으로의 전환에서 비롯됩니다. CD 분광법, 소각 X선 산란 및 NMR과 같은 분광학적 기법을 cryo-EM과 같은 현미경 기법과 결합할 때 얻는 주요 이점은 수중에서의 초분자 폴리머 전이 과정을 측정하고 시각화할 수 있다는 점입니다. 이러한 동적 폴리머는 온도 변화, ONX 강도 변화 또는 pH 변화와 같은 외부 자극에 반응할 수 있습니다.

이러한 방법들의 조합은 광범위하게 적용 가능하며, 분자 화학 및 자기 조립 나노 물질 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 저분자 빌딩 블록의 자기 조립으로 형성된 응집체의 크기와 그 기저에 있는 형성 메커니즘 사이의 상관관계를 조사할 수 있습니다. 이러한 방법론의 영향은 광범위한 바이오 나노 기술 응용 분야로 확대됩니다.

저희는 생의학 이미징 분야와 자가 조립 나노 입자 조영제 개발에 특히 관심을 가져왔으며, 여기서 응집 안정성, 높은 조영 효과, 그리고 자가 조립 조영제의 배출 능력 사이의 정밀한 균형은 임상 적용의 성공을 위해 무엇보다 중요합니다. 저희는 자가 조립 빌딩 블록의 분자 구조에서 발생하는 미세한 변화가 초분자 중합 메커니즘의 근본적인 차이로 이어질 수 있다는 점을 깨달았을 때, 분석 기술들을 결합하는 아이디어를 처음 갖게 되었습니다. 시연은 Trovan 공과대학교의 cryo 10 시설 책임자이자 전문가인 Paul Beaumont이 진행하겠습니다.

서면 프로토콜에 설명된 대로 100 millimolar 시트르산 완충액에 BTA 가돌리늄 DTPA 용액을 준비하여 이 프로토콜을 시작하십시오. 이 비디오와 함께, 1 cm UV Q 큐벳에 해당 용액을 채웁니다. 원형 이색성 분광계의 큐벳 홀더에 큐벳을 삽입하십시오.

230에서 350 nanometers 범위에서 CD 스펙트럼을 측정합니다. 그 다음, 강도가 가장 높은 CD 밴드에서 363에서 283 kelvin까지 분당 one kelvin의 속도로 CD 냉각 곡선을 측정합니다. 이어서, BTA gadolinium DTPA의 시트르산 완충 용액에 2 molar 염화나트륨 완충 용액을 동일한 부피로 첨가합니다.

이렇게 하면 이온 강도가 1 M NaCl로 증가하며 disco의 농도는 절반으로 희석됩니다. 이온 강도를 높인 후 용액을 40초 동안 볼텍싱하고, 230에서 350 nm 범위에서 CD 스펙트럼을 다시 측정합니다. 그런 다음 가장 강한 CD 밴드에서 363 K에서 283 K까지 분당 1 K의 속도로 CD 냉각 곡선을 측정합니다.

가공되지 않은 CD 데이터를 Origin 8.5로 내보냅니다. 가장 높은 측정 온도에서의 CD 효과를 0으로, 가장 낮은 측정 온도에서의 CD 효과를 1로 정의하여 스펙트라를 정규화합니다. CD 효과의 크기는 응집 정도에 비례하므로, 정규화된 CD 곡선은 응집 정도에 비례하게 됩니다. 정규화된 데이터는 Origin Pro 8.5의 비선형 곡선 피팅 옵션을 사용하여 온도 의존적 자가 조립 모델로 피팅합니다.

이 모델에서는 핵 생성 단계와 신장 단계가 구분됩니다. 먼저, 신장 단계에서의 응집도를 맞춥니다. 이 식에서 T는 가변 온도입니다.

PHI N은 응집도에 비례하는 순 헬리시티(net helicity)이며, HE는 신장 분자 엔탈피(molecular enthalpy of elongation)입니다. T TE는 자기 조립이 열역학적으로 유리해지기 시작하는 온도인 신장 온도를 나타냅니다. 정규화 인자 fiat는 응집도가 초과할 수 없다는 제약 조건에 따라 Phi N을 fiat로 나눈 값이 1을 넘지 않도록 하기 위해 도입되었습니다.

Unity fitting을 통해 특정 농도에서 분자의 자기 조립 특성을 나타내는 몰당 줄(jewels per mole) 단위의 신장 엔탈피와 켈빈(Kelvin) 단위의 신장 온도를 추출할 수 있습니다. 피팅 시, 방정식이 신장 영역에서만 유효하므로 TE 미만의 온도에서 응집도만 피팅해야 한다는 제약 조건을 준수하십시오. 첫 번째 방정식을 피팅한 후, 핵 생성 영역 방정식에서 유일하게 알 수 없는 매개변수는 초분자 중합의 협동성을 나타내는 활성화 상수 ka입니다. 활성화 상수를 구하기 위해, 핵 생성 영역의 TE 초과 온도에서 실험적으로 측정된 응집도를 피팅하십시오.

본문에 설명된 대로 전자 현미경용 용액을 준비하는 것으로 시작하십시오. 간단히 100 millimolar 시트르산 완충액과 5 molar 염화나트륨이 용해된 100 millimolar 시트르산 완충액, 두 가지 완충액을 준비하십시오. 준비된 각 완충액 0.1 milliliters에 BTA gadolinium DTPA를 녹여 1 millimolar의 최종 농도를 맞추십시오. 다음으로, 5 milliamps에서 40초 동안 작동하는 C Resington 2 0 8 탄소 코팅 장치를 사용하여 quanti foil 탄소 코팅 그리드를 플라즈마 처리하십시오.

유리화 과정은 광택이 나는 얇은 ISIS 층이 TAM 분석에 적합하게 생성되도록 보장하므로 cryo의 매우 중요한 단계입니다. 자동화된 FEI vitro bot을 이용한 유리화 과정 중에 수용액이 그리드에 도포됩니다. 이 과정은 그리드에 샘플을 도포하고, 과잉 액체를 블로팅하여 그리드 위에 수용액의 얇은 막을 형성한 후, 그리드를 액체 Ethan에 매우 빠르게 침지하여 유리화하는 단계를 포함합니다.

유리화 후 처리된 그리드를 액체 질소로 옮겨 보존하고, 샘플 그리드를 마찬가지로 액체 질소로 냉각된 오토로더 카세트로 수동 이동시킵니다. 다음 단계는 카세트를 TUE cryo Titan, TEM 오토 로더에 삽입하는 것입니다. TUE Cryo Titan은 300 kilovolts에서 작동하는 전계 방사형 총(field emission gun)을 갖추고 있습니다.

TAM 영상을 기록하려면 숙련된 경험과 신속한 조작이 필요합니다. 이는 고에너지 전자빔이 영상 촬영 중에 시편을 손상시키기 때문입니다. 컬럼 후단에 에너지 필터가 장착된 CCD 카메라를 사용하여 영상을 기록하십시오. 가돌리늄은 강한 상자성을 띠어 양성자 신호가 크게 확장되므로, 가돌리늄을 반자성 이트륨과 BT atrium 용액으로 대체한 다른 디스크를 사용하였습니다.

DTPA를 준비합니다. 1 mM의 목표 농도를 달성하기 위해 분자량이 2,979 g/mol인 BT atrium DTPA가 몇 mg 필요한지 계산하십시오. 결정된 양의 BT atrium DTPA를 D₂O 내의 50 mM derated succinate buffer에 녹인 후, 결과 용액 0.6 mL를 Wilm, a LABAs NMR tube에 피펫팅하십시오.

Varian사의 5mm I-D-P-F-G 프로브가 장착된 Nova 500 분광계의 variant unity에 시료를 삽입하십시오. 90도 펄스를 적용하고 혼합 시간을 적절히 최적화하여 표준 proton NMR을 기록한 후, 본문에서 논의된 DOI 실험을 수행하십시오. 난소 표준 프로브 내 HDO의 자기 확산 계수를 결정한 후 DOI 원샷 펄스 시퀀스를 사용하며, 시료 내 응집체의 확산 계수를 결정하여 이를 통해 수력학적 반지름을 계산할 수 있습니다.

마지막으로, 구형 입자의 확산에 대한 Stokes-Einstein 관계식을 사용하여 응집체의 수력학적 반지름 RH를 계산합니다. 주변부 가돌리늄 DTPA 복합체의 이온적 특성은 코어가 길쭉한 막대 모양의 응집체로 중합되도록 설계된 disco 단량체의 1차원 성장에 방해 요인을 도입합니다. 인력과 척력 사이의 균형이 응집체의 크기와 모양을 조절합니다.

방사광 가속기(synchrotron source)는 입자와 용액의 크기 및 형태를 결정하는 강력한 기술입니다. 소각 X선 산란(small angle x-ray scattering) 또는 SAXS를 통해, citrate 완충액에 용해된 gadolinium DTPA의 SAXS 프로파일을 두 가지 서로 다른 농도에서 기록하였습니다.

낮은 Q 영역에서 기울기가 0에 가깝다는 것은 응집체의 형태가 없으며 등방성임을 나타내며, 이는 구형 객체의 존재를 시사합니다. 서로 다른 농도에서 측정된 데이터는 균일한 단분산 구형 형태 인자를 사용하여 피팅되었으며, 이를 통해 계산된 반경은 3.2 nanometers였습니다. 단량체 disco, BTA gadolinium DTPA의 계산된 기하학적 반경은 3.0 nanometers이며, 이는 자기 조립된 객체의 구형 형태와 나노미터 크기에 대한 추가적인 증거를 제공하기 위해 종횡비가 1에 가까운 응집체의 존재를 보여줍니다.

양성자 확산 정렬 NMR 분광법을 수행하였습니다. DOI NMR을 통해 초분자 응집체의 확산 계수를 결정할 수 있으며, 이를 통해 수력학적 반지름을 계산할 수 있습니다. 중수소화된 숙시네이트 완충액 내에서 응집된 반자성 다이코틱 증폭제의 확산 계수는 스토크스-아인슈타인 관계식을 통해 0.69 × 10⁻¹⁰ m²/s로 측정되었습니다.

구형 크기의 개별 객체에 대해 2.9 nanometers의 수력학적 반지름이 계산되었습니다. 이 크기는 BTA gadolinium DTPA의 SOX 데이터로부터 얻은 값과 매우 잘 일치합니다. 1차원 적층 길이의 성공적인 제어에 대한 추가 증거는 cryo TEM 현미경 사진을 통해 확인되었습니다.

BTA gadolinium DTPA는 1 mM 농도에서 직경이 약 6 nm에 가까운 예상된 구형 입자를 생성하며, 이는 SAXS 및 DLS 측정 결과와 일치합니다. 높은 이온 강도에서 cryo-TEM 마이크로그래프를 통해 종횡비가 높은 막대 모양의 초분자 폴리머 형성이 명확하게 관찰됩니다. 이러한 결과의 가장 유력한 원인은 정전기적 차폐(electrostatic screening)로 설명될 수 있습니다.

형태가 직경 약 6 nm의 구형 응집체에서 직경 6 nm, 길이는 수백 nm에 이르는 연장된 막대 모양으로 변합니다. 염 농도가 증가함에 따른 BTA Gadolinium DTPA의 상온 CD 스펙트럼이 여기에 제시되어 있습니다. BTA gadolinium DTPA 농도는 낮은 이온 강도에서 8 × 10⁻³ mM이며, 높은 이온 강도에서는 4 × 10⁻³ mM입니다.

CD 측정에는 상당히 낮은 농도가 적용되었음에도 불구하고, 뚜렷한 cotton 효과는 마이크로몰 농도에서도 온전한 응집체가 존재함을 나타냅니다. 염 농도가 증가함에 따라 CD 스펙트럼의 형태가 변화하는데, 이는 스택 주변부의 반발 상호작용이 감소하고 decos의 패킹이 강화되었음을 보여주는 좋은 지표입니다. 또한, 동일한 용액들의 CD 냉각 곡선에서도 형태상 뚜렷한 차이가 나타납니다.

염 농도가 높아질수록 응집이 시작되는 온도가 더 높은 온도로 이동합니다. CD 효과의 더 급격한 증가로 나타나는 협동적 메커니즘이 더욱 분명해지는 반면, 0 M 염화나트륨에서의 냉각 곡선은 반협동적 과정을 나타내는 ISO smic 자기 조립 모델로 가장 잘 설명됩니다. 1.0 M 염화나트륨에서의 냉각 곡선은 전형적인 협동적 자기 조립 과정이며, 이는 0 M 및 1 M 염화나트륨에서 BTA gadolinium DTPA의 자기 조립에 대한 열역학적 파라미터를 정량화하는 핵 생성 신장 모델로 설명될 수 있습니다.

협동 모델(cooperative model)을 사용하면 무차원 활성화 상수인 ka의 감소가 명확하게 드러납니다. KA 값이 낮을수록 자기 조립 과정에서 협동성의 정도가 더 높음을 나타내며, 이는 매우 길게 연장된 초분자 고분체의 형성으로 나타납니다. cryo TEM에서 관찰된 바와 같이, 제시된 실험 기법을 시도할 때 중요한 점은 여러 실험 방법의 조합만이 연구 대상인 동적 나노 물질에 대한 의미 있는 전반적인 설명을 제공할 수 있다는 것입니다.

이 영상을 시청한 후, 본 연구에서 결합된 실험적 접근 방식의 광범위한 적용 가능성과 자가 조립 나노 재료 및 슈퍼 폴리머 분야의 핵심 질문을 해결하는 데 어떻게 도움이 될 수 있는지 충분히 이해하게 될 것입니다.