T Lymphocytes쪽으로 유도 Pluripotent 줄기 세포의 분화 감독

이 실험 절차의 전반적인 목표는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, IPS cells)로부터 T 림프구를 생성하고 그 특성을 분석하는 것입니다. IPS 세포는 OP9-DL1 배양 시스템에서 체외(in vitro) 분화시킨 후, rag 결핍 마우스 내에서 체내(in vivo) 성숙 과정을 거칠 수 있습니다. 또는 세포를 유전적으로 조작하여 OT-1 TCR을 과발현시킨 후, 체내 발달을 위해 입양 전이를 수행할 수 있습니다.

6주간의 생체 내(in vivo) 분화 후, 마우스의 복강 내에 EEG seven 종양 세포를 주입하여 챌린지하고, 이후 IPS 유래 T 세포의 항원 특이성을 평가할 수 있습니다. 결과적으로 IPS 세포는 일반 T 세포와 항원 특이적 T 세포 모두로 분화할 수 있으며, 후자는 종양 챌린지로부터 동물을 보호할 수 있습니다. 이 기술의 함의는 개별 맞춤형 암 면역 요법으로 확장될 수 있습니다.

이 방법은 환자의 소량의 혈액 또는 피부 조직으로부터 다수의 종양 반응성 T 세포를 생성할 수 있게 합니다. 0일 차에 20% FBS alpha MEM 배지가 포함된, OP9-DL1 세포 단층이 형성된 100mm 배양 접시에 5×10⁴개의 iPS 세포를 옮깁니다. 5일 차에 트립신 처리 후 세포를 원심 분리합니다. 새로운 100mm 배양 접시에서 37°C 인큐베이터 내에 30분 동안 배양한 뒤, OP9-DL1 세포 단층이 있는 새로운 100mm 접시에 부유 세포 5×10⁵개를 20% FBS alpha MEM 배지 및 mouse Flt3 ligand와 함께 분주합니다. 8일 차에 느슨하게 부착된 세포를 피펫으로 조심스럽게 떼어내 원심 분리한 후, OP9-DL1 세포 단층이 코팅된 6웰 배양 플레이트의 단일 웰로 세포를 옮깁니다. 세포를 37°C, 5% CO₂ 조건에서 2주 더 배양합니다. 22일 차에.

분리된 IPS 세포를 새 배양 접시에 넣고 37 °C의 신선한 배지에서 30분 동안 배양합니다. 그 후 부유 세포의 약 절반을 제거하여 70 µm 나일론 스트레이너에 통과시켜 세포 덩어리를 제외하고, 이렇게 얻은 단일 세포 현탁액을 차가운 PBS로 3회 세척합니다. 3회 세척 후, 세포를 1.5 × 10⁷ cells/mL 농도의 PBS에 재현탁하고 정맥 주사 전까지 얼음 위에서 유지합니다.

4주 된 rag 결핍 마우스를 적외선 램프 아래에 두어 꼬리 정맥을 확장시킵니다. 그런 다음 26.5 gauge 바늘이 장착된 1 mL 주사기에 세포 현탁액 200 µL를 채우고, 확장된 꼬리 정맥을 통해 세포를 입양 이식합니다. 3주 후, 입양 이식된 마우스의 안락사를 확인한 뒤, 조직을 기계적으로 분쇄하여 림프절과 비장을 적출합니다.

CK 용해 완충액으로 단일 세포 현탁액을 용해시킨 후, 생성된 단핵구를 차가운 PBS로 두 번 세척합니다. 그 다음 세포 표면 마커를 염색하고, 0일 차에 유세포 분석으로 세포를 평가합니다. 1일 차에 gene JAMA 형질전환 시약을 사용하여 OT one MIDR이 포함된 plat E 패키징 세포를 하룻밤 동안 형질전환합니다. 2일 차에 0.1% 젤라틴으로 사전 코팅된 24-웰 플레이트의 한 웰에 1 × 10⁶개의 iPS 세포를 분주합니다. plat E 세포에서 S natin을 포함하는 유사 바이러스를 수집한 후, 원심분리 후 잠재적 오염 물질을 제거하기 위해 0.4 µm 필터로 여과합니다. 폴리브레인 존재 하에 32 °C, 330 ×g 조건에서 1시간 동안 세포를 형질도입합니다.

형질도입 절차를 반복한 후 동일한 온도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 4일째에 트립신을 사용하여 형질도입된 IPS 세포를 떼어내고, 원심분리하여 펠렛을 형성한 후, 세포를 신선한 배지에 재현탁하여 미리 코팅된 방사선 조사 snl 7 6 7 피더 세포 위에 파종합니다. 형질도입된 세포가 합류 상태(confluency)에 도달하면, 유세포 분석기를 통해 GFP와 DS red 이중 양성 세포를 분리합니다.

IPS 세포를 입양 전이시킨 6주 후, 종양 유도 50일째에 동일한 마우스의 복강 내로 50 µL의 EEG seven thoma 세포를 주입합니다. Miltenyi Biotec의 CD8 양성 T 세포 분리 키트를 사용하여 입양 전이된 동물의 비장과 림프절에서 CD8 양성 T 세포를 분리합니다. 분리된 CD8 양성 T 세포를 나이브 C57BL/6J 마우스 유래의 방사선 조사된 SPOC 세포와 1:10 비율로 혼합하고, 0.5 µmol/mL의 OVA로 40시간 동안 공동 배양하여 펄싱합니다.

그 후, 세포에 felden A를 추가하고 4시간 동안 더 처리합니다. 마지막으로, 유세포 분석을 통해 세포 군집을 평가합니다. naive C 57 black six J 마우스에서 SP 세포를 분리한 후, 세포 현탁액을 두 그룹으로 나눕니다.

CFSE high 군은 5 µM CFSE로 염색하고 10 µg/ml ova 펩타이드로 1시간 동안 펄싱하며, CFSE low 군은 0.5 µM CFSE로 염색하고 펄싱하지 않습니다. PBS 내에서 2.5 × 10⁶ 개의 CFSE high 세포와 2.5 × 10⁶ 개의 CFSE low 세포를 혼합합니다. 그 후 유세포 분석기를 통해 세포의 CFSE 발현을 분석합니다.

관심 마우스에 입양 전이를 수행한 16시간 후, 종양 챌린지 20일 차에 복강 내 종양 세포 수를 측정합니다. 18.5게이지 바늘이 장착된 10밀리리터 주사기와 차가운 PBS를 사용하여 복강을 세척합니다. 회수된 종양 세포 수를 측정하여 종양 침윤 세포를 확인합니다.

종양 유도 후반 단계에서 종양을 제거한 다음, 종양을 세 조각으로 자릅니다. 첫 번째 종양 조각을 크라이오 바이알(cryo vial)에 넣고 바이알을 드라이아이스 위에 둡니다. 두 번째 조각은 즉시 포르말린(formaldehyde)으로 고정합니다.

동결 보존된 조직 절편을 공기 건조시킨 후, 세 번째 조각을 조건화된 RPMI 1640 배지에 보존하십시오. 고정된 절편을 다시 15분 동안 공기 건조시킨 후, 차가운 아세톤에서 15분 동안 고정하십시오. 세척 후 슬라이드를 PBS로 5분 동안 세척하십시오.

슬라이드를 습윤 챔버에 넣고 비특이적 결합을 차단하기 위해 3%B, SA 및 PBS 30 µL를 조직 절편 위에 도포하여 30분 동안 둡니다. 그 다음 블로킹 버퍼를 닦아내고, 3%PSA가 포함된 PBS에 희석한 pe anti TCR RV alpha two 항체와 fitzy anti ova 항체 혼합액 50 µL를 조직 절편에 처리하여 습윤 챔버 내에서 2시간 동안 반응시킵니다. 반응이 끝나면 슬라이드를 차가운 PBS로 3회 세척합니다. 마지막으로 종양 침윤 T 세포의 유세포 분석을 위한 형광 현미경 검사 전, 수성 마운팅 매질을 사용하여 절편을 마운팅합니다.

종양을 눌러 단일 세포 현탁액으로 만듭니다. 그런 다음 세포의 특정 표면 마커를 분석합니다. T 세포의 마커로 CD3와 TCR beta가 사용되며, notch 리간드 DL1을 이용한 iPS 세포의 자극이 T 세포 발달에 기여할 수 있는지 확인하기 위해, CD3 양성 및 TCR beta 양성 iPS 세포 유래 세포에서 CD4 및 CD8 세포 표면 발현 여부를 평가하였습니다.

오른쪽의 도트 플롯(dot plot)은 in vitro에서 iPS 세포로부터 생성된 day 22 CD3 양성, TCR $\beta$ 양성, CD4 음성, CD8 양성 단일 양성 T 세포를 보여줍니다. 또한, 이전 그림의 iPS 세포 유래 단일 양성 세포들은 plate에 코팅된 anti-CD3 및 수용성 anti-CD28 항체에 의해 in vitro에서 자극되었을 때 interleukin 2와 interferon $\gamma$를 생성하였으며, 이는 iPS 세포 유래 T 세포가 수용 마우스로의 입양 전이 후에도 기능적임을 확인시켜 줍니다. TCR 유전자가 형질전환된 iPS 세포의 대부분은 CD8 양성 CTL로 분화되었으며, 이들은 통합된 림프절 및 비장 세포에서 얻은 이 도트 플롯들에서 보듯 펩타이드 자극에 대해 interleukin 2와 interferon $\gamma$를 분비함으로써 in vitro에서 반응하였습니다.

TCR이 형질전환된 IPS 세포를 입양 전이한 마우스에서는 CD8+ Vβ5+ T 세포가 생성되었으나, 대조군 형질전환 마우스에서는 생성되지 않았습니다. CD8+ Vβ5+ 집단은 인터루킨 2 및 인터페론 감마 생성에 대한 세포 내 사이토카인 염색 결과 양성을 보였으며, 이는 히스토그램에서 음영 처리된 동형 대조군 히스토그램과 비교하여 진한 선으로 표시되어 IPS 유래 CTL이 기능적임을 나타냅니다. 이 데이터는 IPS 세포 전이 10주 후 또는 O OT1 CTL 전이 1일 후에 마우스에 주입된, 각 그래프의 오른쪽 피크로 표시된 펩타이드 처리 CFSE high 세포와 왼쪽 피크로 표시된 CFSE low 대조군 세포를 보여줍니다.

항원 특이적 IPS 유래 CTL은 항원 자극에 반응하였으며, 여기에서 CFSE high 세포가 소실된 것으로 나타난 바와 같이 세포 독성 활성을 보였습니다. OT-I TCR 유전자가 도입된 IPS 세포를 C57BL/6 마우스에 입양 전이한 후, EEG 7 종양 세포를 챌린지하였습니다. 20일째에 복강 내의 종양 세포 수를 측정하였습니다. 대조군과 비교하여 TCR이 도입된 IPS를 투여받은 마우스에서 종양 세포 수가 유의미하게 감소했음에 주목하십시오.

가장 중요한 점은, TCR이 형질전환된 iPS 세포의 입양 전이가 과발현된 CTL의 종양 조직 내 침윤을 유도하였으며, 종양 도전 후 30~35일에 회수된 종양 조직의 H&E 염색 결과에서 알 수 있듯이 동물을 종양 도전으로부터 보호했다는 것입니다. TCR 형질전환 세포 또는 OT-I CTL을 입양 전이한 마우스의 종양에서는 이러한 현상이 나타났으나, 모의 주입군이나 대조군에서는 나타나지 않았습니다. 여기서 빨간색 화살표로 표시된 바와 같이, 형질전환된 세포에는 염증 세포가 침윤되었습니다. 빨간색으로 표시된 Ova 특이적 Vα2 양성 CTL이 초록색으로 표시된 Ova 발현 종양 조직로 침윤된 것이 확인되었습니다.

대조군 그룹의 마우스 종양에서는 이 그림에서 종양 침윤 세포가 적거나 없었지만, CD8 양성 세포군을 게이팅한 후 유세포 분석법을 통해 종양 조직의 단일 세포 현탁액에서 V alpha two 양성과 V beta five 양성의 발현을 분석하였습니다. TCR-형질전환 iPS 세포를 입양 전이한 마우스의 종양 조직에서는 종양 침윤 세포의 수준이 가장 높게 나타난 반면, 대조군 형질전환 iPS 세포를 투여받은 마우스의 종양에서는 ova 특이적 CD8 양성 T 세포의 침윤이 나타나지 않았음에 유의하십시오.

이 영상을 시청하고 나면, iPS 세포로부터 항원 특이적 T 세포를 생성하는 방법과 iPS 유래 T 세포의 기능을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.