Planarian의 부동화, 부분 조사 및 조직 이식

다음 실험의 전반적인 목표는 재생 과정 중 줄기세포와 그 후손 세포의 행동을 in vivo에서 분석하기 위해, 파리안(parian) 내의 줄기세포가 제거된 조직 인근에 건강한 줄기세포 집단을 배치하는 것입니다. 이는 조사되지 않았거나 Leafly 조사가 완료된 파리안을 마취 및 고정하여 추가 조작을 가능하게 함으로써 달성됩니다. 그다지, 고정된 미조사 파리안의 일부를 납으로 차폐한 후 X-ray를 조사하는데, 이를 통해 줄기세포가 유지된 차폐 조직과 줄기세포가 제거된 조직이 인접한, 손상되지 않은 파리안을 생성합니다.

대안적으로, 조사되지 않은 공여체로부터 채취한 조직 이식편을 이전에 조사된 수용체에 이식하여 줄기세포의 단일 집단을 가진 개체를 생성할 수 있습니다. 줄기세포가 제거된 수용체 내에 줄기세포가 존재하게 되며, 줄기세포 표지 유전자에 대한 whole mount RNA in situ hybridization을 통해 줄기세포 제거 조직 인접 부위에서 단일 줄기세포 집단이 관찰되는 결과를 얻을 수 있습니다.

따라서 여기서 설명하는 방법들은 이식 패러다임과 부분 방사선 조사 패러다임 모두에서 줄기세포의 행동을 연구함으로써 재생 플라나리아를 더 잘 이해하는 것을 목표로 하며, 이를 통해 이러한 줄기세포가 존재하는 주변 조직과 국소 환경이 네오블라스트(neoblasts) 또는 줄기세포의 행동에 영향을 미치는지 여부를 테스트할 수 있습니다. 재생 과정 중, 실험 1~2개월 전에 동반된 원고에 따라 플라나리아에게 먹이를 공급하십시오. 본 시연에서 원하는 크기를 얻기 위해, 길이는 1~2cm 사이이고 너비는 2mm보다 넓은 플라나리아를 선택합니다.

그 후 사용 3~7일 전에 기아 상태로 둡니다. 다음으로, 0.1~0.2% w/v clionone을 pyrian water에 용해하여 약한 국소 마취제인 Chloro tone 용액을 준비합니다. 그다음 조직 이식을 위해 용액을 얼음 위에서 냉각시키고, 분젠 버너를 사용하여 내경 0.75 millimeter인 모세관의 끝에서 1~2cm 지점을 90도 각도로 구부려 이식 조직을 절단할 준비를 합니다.

그런 다음, 외경 0.7 millimeter의 다른 모세관을 끝단에서 1~2 centimeter 지점에서 90도 각도로 굽혀, 이식물을 수용할 숙주 내 구멍을 생성할 준비를 합니다. 이어서, 함께 제공된 원고에 명시된 크기에 따라 검은색 Whatman 3번 여과지와 Kimwipe, 그리고 담배 말이용 종이를 자릅니다.

그 후, 수정된 Holt Fers 용액과 Caine 포화 Holt Fretter 용액을 준비합니다. 두 용액 모두 4°C로 냉각시킵니다. 그런 다음, 접은 킴와이프(Kim wipe)를 파라폼(Paraform) 사각형에 부착합니다.

해부 현미경 하에서 이를 펠티어 쿨러 플레이트 또는 다른 냉각 장치 위에 놓습니다. 이어서 차갑게 식힌 Holt Fretter 용액으로 킴와이프(Kim wipe)를 적십니다. 그런 다음 킴와이프 위에 두 개의 검은색 여과지 직사각형 조각을 올립니다.

이제 왓만(Watman) 2번 여과지를 페트리 접시에 놓습니다. Holt Fretter 용액으로 여과지를 적신 후, 부분 조사를 위해 접시를 얼음 위에 올려 냉각시킵니다.

조직 이식과 유사하게, 더 큰 접시에 더 큰 종이 라이너를 넣습니다. 필터 페이퍼를 Holt Fretter 용액으로 적십니다. 그런 다음 접시를 얼음 위에 올려 냉각시킵니다.

이 절차에서는 페트리 접시에 차가운 클레온(cleone) 용액을 채웁니다. 이식을 위해 플라나리아를 피펫으로 접시에 옮깁니다. 한 번에 하나의 숙주와 하나의 공여자만 마취하십시오.

부분 조사를 위해 여러 마리의 동물을 한꺼번에 마취할 수 있습니다. 그 다음 paria가 움직이지 않을 때까지 cleone 용액에 5~10분 동안 담가 둡니다. chilled Holt Fretter 용액이 채워진 접시에 피펫으로 옮겨 paria를 헹굽니다.

그 후, 차갑게 식힌 Holt fretter 용액이 적셔진 검은색 여과지 위에 피펫팅하여 plin 영역을 고정합니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 복측이 아래를 향하도록 배치합니다. 이제 앞서 준비하여 아이스 버킷에 넣어둔 차가운 페트리 접시를 상단 소스 X-선 조사기 내부에 들어갈 수 있도록 배치합니다.

검은색 여과지를 옮겨 마취된 플란(plan) 영역을 페트리 접시에 배치하십시오. 그런 다음 이를 상단 소스 X선 조사기로 옮기고, 음극관에서 표본까지의 거리가 최소화되도록 아이스 버킷을 배치하십시오. 이를 통해 유효 선량률을 최대화합니다.

그 다음, x-ray 조사를 위해 파리아(paria)와 음극관 사이에 납 차폐막을 배치하십시오. 차폐되지 않은 영역에서 완전한 줄기세포 제거를 원하는 경우, 30 grays 이상의 선량을 조사하십시오. x-ray 조사가 끝난 직후, 파리아를 냉각된 파리아수로 옮기십시오.

그 후, 파리안 워터(parian water)가 실온으로 따뜻해지도록 두고 동물이 검은색 여과지에서 스스로 떨어져 나오게 합니다. 이제 부분 조사 절차가 완료되었습니다. 해부 현미경 하에서 이 절차를 시작하려면, 펠티어 소자 또는 냉각 플레이트에서 미리 냉각시킨 킴와이프(Kim wipe) 위에 마취된 숙주와 공여체 플린 영역을 각각 별도의 직사각형 검은색 여과지에 배치하십시오.

내경 0.75 millimeter 모세관을 사용하여 공여체에서 이식 플러그를 절제합니다. 그다음 핀셋을 사용하여 이를 수용체의 방해되지 않는 부위에 배치합니다. 이후 외경 0.7 millimeter 모세관을 사용하여 수용체에서 플러그를 제거합니다.

그 다음 이식물을 구멍에 배치합니다. 직사각형의 검은색 여과지에 있는 이식된 숙주를 앞서 준비한 페트리 접시로 옮깁니다. 롤링 페이퍼 한 조각을 Caine 포화 Holt Fretter 용액으로 적십니다.

그런 다음 이를 이식된 호스트 위에 놓습니다. 다음으로, 포화 Holter 용액을 적신 필터 페이퍼 4장을 준비하고, 이식된 호스트가 가라앉을 경우를 대비해 포화 Holt Fretter 용액을 적신 절단된 Kim wipe 뭉치 4개를 준비합니다. 이를 필터 페이퍼 위에 덮어줍니다.

그 후, 뚜껑을 닫습니다. 페트리 접시를 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 공여체 parian을 회복 및 재생을 위해 parian수로 옮깁니다.

모든 이식을 완료한 후, 이식된 parian을 10 °C 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 둡니다. 다음 날 아침, parian을 parian water가 채워진 페트리 접시로 옮깁니다. parian이 거름종이에서 스스로 떨어지도록 두거나 핀셋으로 조심스럽게 제거하며, 이후 2~3일마다 한 번씩 parian water를 교체합니다.

방사선 조사 후 3일 뒤에 고정한, 조사되었으나 완전히 차폐된 대조군 parian의 hole mount in situ hybridization 결과는 야생형 parian과 구별할 수 없는 줄기세포 분포를 보여줍니다. 반면, 전단과 후단이 노출되도록 부분적으로만 차폐된 parian의 경우, 차폐되지 않은 영역에서 줄기세포가 소실된 것으로 보입니다. 여기에는 성공적으로 이식된 parian의 등쪽 및 배쪽 모습이 나와 있습니다.

이식 3일 후, 이식편은 등쪽과 배쪽 표면 모두에서 명확하게 관찰되며, 이식편과 숙주 사이의 접합부에는 특징적인 무색 조직이 둘러싸고 있습니다. 반면, 이식에 실패한 경우에는 이식 부위에서 가시적인 이식 조직이 나타나지 않습니다. Whole mount in situ hybridization 결과, 줄기세포가 이식 위치 내부 또는 주변에서만 확인되었으며, 이는 숙달된 기술로 이식이 성공적으로 이루어졌음을 나타냅니다.

이식은 각각 최소 5분 만에 완료할 수 있습니다. 성공률이 90에서 100%에 달하며, 부분 조사는 크게 확장될 수 있습니다. 이는 조사기의 조사 영역이 충분히 크다고 가정했을 때 가능합니다.