Dopaminergic 신경 세포 개발에서 유전자 기능을 유학 칙의 Midbrain에서 비켜 Electroporation에

본 실험은 중뇌 발달 및 도파민성 뉴런 분화에 미치는 외인성 유전자 발현의 영향을 연구하기 위한 병아리 중뇌의 in ovo 전기천공법을 시연합니다. 먼저, 발달 중인 중뇌 소포에 외인성 DNA를 특이적으로 표적화하기 위해 hamburger Hamilton 단계 11의 병아리 배아 중뇌에 원하는 플라스미드 DNA를 주입합니다. 그 후, 맞춤 제작된 소형 전극을 사용하여 중뇌 소포에 전기천공을 실시함으로써 외인성 DNA를 중뇌 신경 전구세포에 특이적으로 전달합니다.

다음으로, 중뇌에서 M cherry 발현이 양호한 23단계 배아를 수확하여 최적의 중뇌 횡단면을 제작합니다. 최종적으로, tyrosine hydroxylase와 같은 도파민성 신경세포 마커에 대한 면역 염색 분석을 통해 관심 유전자의 발현에 의해 유도된 신경 전구세포의 성숙한 도파민성 신경세포로의 분화를 확인할 수 있습니다. 기존의 다른 in ovo 전기천공법 대비 이 기술의 주요 장점은 본 프로토콜을 통해 막 특이적 전기천공을 달성함으로써 도파민성 신경세포 분화를 연구할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 중뇌 발달에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 신경계의 다른 부위에 적용하여 운명 지도 작성 분석을 수행하거나 유전자 발현 조절을 조사하는 데에도 활용될 수 있습니다. Hamburger Hamilton stage 11 배아를 얻으려면, 각 수정란을 옆으로 눕히고 윗부분에 연필로 표시를 합니다. 그런 다음 트레이를 예열된 습윤 인큐베이터 내의 로커에 놓습니다.

수정 후 41시간에 24시간마다 습도와 수위를 확인합니다. 배양기에서 알을 꺼내 실온에 보관합니다. 각 알의 표면을 70% ethanol로 세척하고 닦아냅니다.

이제 4 cm 길이의 스카치테이프 두 조각을 달걀 위에 나란히 붙여 연필 표시 위에 커다란 직사각형을 만듭니다. 테이프를 달걀 표면에 밀착시켜 창을 만든 후, 18 gauge 바늘이 장착된 10 mL 주사기를 준비합니다. 배아를 방해하거나 손상시키지 않도록 바늘을 노른자 반대 방향으로 기울여 달걀 껍질을 뚫습니다.

달걀에서 알부민 5 mL를 추출합니다. 바늘을 70% ethanol로 세척합니다. 다음 달걀을 찌르기 전에 바늘의 물기를 말립니다.

화염 갈색 마이크로 피펫 풀러(flaming brown micro pipette puller)의 설정을 입력하십시오. 그런 다음 P 10 피펫을 사용하여 박벽 모세관 튜브를 주입용 바늘로 당겨 만듭니다. 롱 팁 모세관 피펫 팁에 5~10 µL의 플라스미드 용액을 흡입하십시오.

그 다음, 공기 방울이 없도록 연속적인 기둥 형태로 유리 니들을 천천히 채웁니다. 채워진 니들을 마이크로 매니퓰레이터와 마이크로 인젝터에 연결된 니들 홀더에 장착합니다. 이제 해부 현미경 아래에서, 니들을 더 잘 시각화하기 위해 어두운 배경을 사용하여, 녹색 액체가 멈춘 지점에서 스프링 가위로 니들을 다듬습니다.

이전의 바늘 구멍 부위에서 지름 2~2.5cm 크기의 창을 냅니다. 이는 알부민을 추출하기 위함입니다. 절개하는 동안 한 손으로 달걀을 회전시키십시오.

알 사이에 가위의 오염물을 70% ethanol을 적신 kim wipe로 닦아내는 것을 잊지 마십시오. 해부 현미경으로 병아리 배아를 관찰합니다. 필요한 경우, 병아리 배아 아래에 0.22 micrometer 필터링된 PBS 내 20% India ink를 주입하여 배아를 시각화합니다. 배아의 머리가 바늘 반대 방향을 향하도록 하여 배아를 바늘의 경로와 평행하게 배치합니다.

중뇌와 후뇌의 접합부에서 45도 각도로 신경관을 천천히 찌릅니다. 지속 시간을 25 milliseconds로 설정한 pico spritzer 미세 주입기로 주입을 시작합니다. 바늘의 상태에 따라 시간을 조절하여, Fast Green 염료가 포함된 플라스미드 DNA를 중뇌에 해당하는 신경낭에만 채웁니다.

주입 바늘을 회수한 후, 배아 위에 pen strep 용액 세 방울을 떨어뜨립니다. 효율적인 전기천공을 위해 B-T-X-E-M-C eight 30 electro por의 설정을 확인합니다. 복측 중뇌 위치에서, 맞춤 제작된 작은 L자형 백금 전극을 신경관 바닥과 동일한 수평 높이에 배치하여 배아의 중뇌가 두 전극 사이에 중앙에 오도록 합니다.

BTX 풋 스위치를 한 번 누르고 전극 주변에 생성되는 기포를 확인하십시오. 전기천공이 성공적으로 이루어질 때마다 전극을 알에서 조심스럽게 제거하고 닦아내십시오. 70% ethanol을 적신 화학 와이프로 닦은 후, 배아 위에 pen strep 용액을 다시 세 방울 떨어뜨리십시오.

이제 투명 포장 테이프 5cm x 5cm 조각으로 창을 덮습니다. 달걀 내부 내용물을 건드리지 않고 달걀을 잘 밀봉한 후, 회전 장치를 끈 상태로 달걀을 다시 인큐베이터에 넣습니다. 원하는 단계에 도달하면, 각 조건별로 살아있는 배아를 PBS가 채워진 공용 페트리 접시에 수확합니다.

다음으로 형광 해부 현미경을 사용합니다. 수확한 배아에서 m cherry 발현 여부를 스크리닝하고, 양성 배아를 24웰 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 각 웰에 갓 제조한 2%para formaldehyde 1 mL를 넣고 4 °C에서 3시간 동안 배양합니다.

고정된 배아를 PBS로 3회 세척하고, 평형 상태에 도달할 때까지 15% sucrose에 둡니다. 30% sucrose에서 평형 과정을 반복한 후, 각 배아를 OCT에 매립하고 최적의 중뇌 횡단면을 얻을 수 있도록 배아의 방향을 적절히 잡습니다.

배아 닭의 중뇌 in ovo 전기천공 분석(electroporation assay)에서 이후 분석을 위해 두꺼운 중뇌 조직의 18 micron 두께 cryostat 절편을 준비합니다. hh 단계 11의 닭 배아에 m cherry 형광 마커와 표적 유전자가 포함된 플라스미드 칵테일 및 주입 과정을 추적하기 위한 fast green 염색 추적자를 주입합니다. 중뇌 전기천공 후 배아를 추가로 배양하고, m cherry 양성 배아를 수확하여 고정 및 포매합니다.

그 다음으로 중뇌 동결 절편을 제작합니다. 주입 및 전기천공이 성공적으로 이루어진 병아리 배아에서 tyrosine hydroxylase와 같은 중뇌 마커를 이용한 면역 염색으로 시료를 분석합니다. m cherry 발현을 주입 마커로 사용하여 추가 발달 후 중뇌 영역에서 m cherry 발현을 일반적으로 확인할 수 있습니다.

m cherry 발현이 적절하게 나타나는 배아를 고정한 후, 포매하여 중뇌 동결 절편을 준비할 수 있도록 방향을 잡습니다. 여기서는 m cherry 및 flag 태그가 붙은 유전자가 도파민성 뉴런 마커인 tyrosine hydroxylase와 함께 공동 국소화되는지를 통해, 전기천공법이 적용된 신경 전구세포의 도파민성 분화를 확인합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 중뇌 부위에 특이적으로 DNA 구조체를 주입하는 방법과 맞춤 제작된 소형 전극을 사용하여 전기천공 위치를 정밀하게 지정하는 방법을 포함하여, 배아 중뇌 도파민성 뉴런 전구세포에 유전자 발현을 지역적으로 제한하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

RNI 매개 락다운(lockdown)이나 리포터 유전자에 연결된 인핸서의 발현과 같은 다른 방법들을 통해 신경계의 특정 영역 및 세포 유형에서 유전자 기능과 유전자 조절을 연구할 수 있습니다.