랫 Splenocytes에서 T 세포 성장 인자 준비

안녕하세요, 저는 Christine Beaton입니다. 저는 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스의 생리학 및 생물물리학과에 있는 George Chen 교수님 연구실의 보조 연구원입니다. 앞으로 이틀 동안 T 세포 성장 인자를 의미하는 TCGF를 준비하는 방법을 보여드리겠습니다.

따라서 배양 배지 내 사이토카인 조성에 대한 정밀한 정보가 필요하지 않은 일반적인 세포 배양의 경우, T 세포의 증식에 필요한 사이토카인들이 포함된 비장세포 배양 상층액인 T-cell growth factor(TCGF)를 사용합니다. TCGF를 준비하는 방법은 건강한 Lewis 쥐를 희생시켜 비장을 적출하고 단일 세포 현탁액을 만든 뒤, 용혈을 통해 적혈구를 제거하는 것입니다. 그 다음, 단핵 세포를 Concanavalin A로 자극하여 T 세포가 성장에 필요한 모든 사이토카인을 생성하도록 유도합니다. TCGF를 생성하기 위해서는 세포를 활성화해야 합니다.

저희가 수행하는 방법은 세포 배양물에 렉틴 con A(concanavalin A의 약어)를 첨가하는 것입니다. 세포 배양물에 con A를 첨가하면, 이것이 당화된 T 세포 수용체 복합체에 결합하게 되며, 동시에 여러 복합체에 결합하면서 소위 캡핑(capping)이라 불리는 현상을 일으킵니다. 즉, 세포 표면의 모든 수용체를 응집시켜 클러스터를 형성하며, 이는 T 림프구의 활성화 신호를 유도하게 됩니다.

세포가 활성화된 후에는 분열(blast)을 시작하게 됩니다. 즉, 세포의 크기가 커지고 사이토카인을 분비하기 시작합니다. 원래 우리는 TCGF가 주로 interleukin two라고 생각했으나, 현재는 그렇지 않다는 것을 알고 있습니다.

또한 여기에는 interferon gamma, TNF alpha 그리고 아마도 배양 48시간 후의 세포 생존에 필요한 아주 소량의 사이토카인들이 포함되어 있을 것입니다. 세포들이 우리가 필요로 하는 모든 사이토카인을 생성했으므로, 이제 세포를 제거하겠습니다. 세포를 제거하고 상층액만 남게 되면, 상층액 속에 여전히 일부 유리 conal이 존재하게 됩니다. 우리는 T세포 성장 인자를 T세포주를 계속 성장시키는 데 사용하고자 하므로, 이는 문제가 될 수 있습니다.

또한, Con A가 자유 상태로 남아 있게 되면, 원하지 않는 시점에 세포가 활성화될 수 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 모든 자유 Con A에 결합할 수 있는 과량의 당을 첨가할 것입니다. 그렇게 하면 Con A가 완전히 비활성화되어, 배양액에 TCFGF를 첨가했을 때 세포의 다른 당화 수용체에 결합하지 않게 됩니다.

그럼 시작하겠습니다. 이 실험의 첫 번째 단계는 안락사 직후 쥐의 비장을 적출하는 것입니다. 지금 바로 멸균 도구를 사용하여 적출하도록 하겠습니다.

비장을 적출한 후, 항생제가 첨가된 PBS에 넣겠습니다. 항생제로는 penicillin과 streptomycin을 사용합니다. 이제 시작하겠습니다. 먼저 배양물에 오염이 발생하지 않도록 쥐에게 70% ethanol을 분사합니다.

그런 다음 기구를 사용하여 이곳의 피부를 작게 절개합니다. 이어서 근육층을 제거하면 이곳에 비장이 나타납니다. 다른 핀셋을 사용하여 비장이 손상되지 않도록 조심스럽게 꺼냅니다.

이와 같이 연결 조직을 제거합니다. 이제 비장을 확보했습니다. 물론 복강 내의 다른 부위가 손상되지 않도록 매우 주의해야 합니다. 장에 손상이 생기면 비장이 즉시 오염되기 때문입니다.

그런 다음 비장을 PBS와 항생제가 포함된 튜브로 옮깁니다. 이 튜브는 얼음 위에 보관합니다. 이제 쥐 3마리로부터 비장 채취를 완료했습니다.

이제 비장에서 단일 세포 현탁액을 준비하겠습니다. 적출한 비장을 조직 배양 후드로 옮겨 70 µm 세포 여과기를 사용하여 단일 세포 현탁액을 제조하겠습니다. 비장에서 단일 세포 현탁액을 만들기 위해 몇 가지 준비물이 필요합니다.

멸균된 기구인 핀셋 한 쌍과 가위 한 쌍이 필요합니다. 그런 다음 페트리 접시에 멸균된 1 mL 주사기의 플런저를 준비합니다. 비장 조직을 항생제가 포함된 PBS에 넣겠습니다.

그리고 또 다른 페트리 접시에는 10 mL의 PBS와 항생제 혼합액에 70 µm 세포 스트레이너(cell strainer)를 넣어 두었습니다. 첫 번째 단계는 비장이 깨끗한지 확인하는 것입니다. 여기 보시는 것처럼 결합 조직 조각들이 남아 있는데, 이를 제거하지 않으면 세포 스트레이너가 매우 빠르게 막히기 때문에 제거해 주어야 합니다. 이를 위해 불필요한 부분을 잘라내어 페트리 접시 뚜껑에 버립니다.

이제 비장 조직이 대부분 깨끗하게 정돈되었으므로, 비장을 하나씩 꺼내 셀 스트레이너(cell strainer)에 넣고 작은 조각으로 자릅니다. 그리고 세 개의 비장을 모두 섞습니다. 다음 단계는 단일 세포 현탁액(single cell suspension)을 만드는 것입니다. 모든 과정을 멸균 상태로 유지해야 하므로, 셀 스트레이너를 직접 만지지 않고 멸균된 1 mL 주사기의 플런저를 사용하여 비장 조각들을 셀 스트레이너로 밀어 넣습니다.

셀 트레이너 외관에서 보시는 바와 같이, 단일 세포 부유액을 제조하고 있습니다. 첫 번째 과정에서는 아직 비장의 작은 조각들이 일부 남아 있지만, 여기서 단일 세포 부유액을 분리해 내겠습니다. 분리한 부유액은 이미 얼음에 보관 중인 50 mL 튜브로 옮겨 담았습니다.

그리고 셀 스트레이너에 PBS와 항생제 혼합액 10 mL를 더 채우겠습니다. 약 10 mL의 PBS 및 항생제 혼합액을 취하는데, 세척 과정이므로 정확히 10 mL일 필요는 없습니다. 이를 셀 스트레이너에 넣고 동일한 절차를 수행합니다.

주사기 플런저를 다시 사용하여 ocid를 조금 더 밀어냅니다. 결합 조직과 제거하지 못한 작은 지방 조각들이 세포 스트레이너에 남게 되므로 당연히 모든 내용물을 다 밀어낼 수는 없습니다. 하지만 비장의 대부분은 세포 스트레이너로 옮겨져야 합니다.

그런 다음 이전에 수행한 과정을 그대로 반복합니다. 단일 세포 현탁액을 수확하여 동일한 치아에 추가하겠습니다. 이때쯤이면 세포 스크리너의 스크린에 남은 것이 거의 없으며, 배출되는 PBS가 훨씬 더 투명해집니다. 이제 한 번 더 세척하면 대부분의 세포가 회수되었을 것입니다.

이제 PLE 세포의 단일 세포 현탁액이 준비되었으므로, 단순히 펠렛(pellet)을 형성하기 위해 원심분리하겠습니다. 8~10분 동안 원심분리하면 충분합니다. 이제 PLE 세포를 원심분리하여 깨끗한 펠렛을 얻었습니다.

이제 상층액을 제거한 다음 적혈구를 용해하겠습니다. 근세포를 0.15 M 염화암모늄 용액에 현탁시킬 것이며, 비장 하나당 5 mL를 사용하겠습니다.

비장 3개를 사용하므로, 15 milliliters의 염화암모늄을 얼음 위에서 처리하겠습니다. 적혈구를 용해시키기 위해 3분 동안 파이펫으로 부드럽게 섞어줍니다. 이제 노출값이 더 높은 이 테이크를 사용하겠습니다.

이제 3분 동안 전해세포(electrocytes)를 분석했습니다. 튜브에 PBS를 채우겠습니다. 배지를 사용하셔도 됩니다. 이는 용액의 삼투압을 세포의 정상 범위로 되돌리기 위함입니다.

그리고 이전과 마찬가지로 세포를 펠렛화하기 위해 8~10분 동안 원심분리하겠습니다. 그런 다음 항생제가 포함된 동일한 PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다. 이제 전해질을 용해시킨 후 세포를 원심분리합니다. 전해질이 100% 방출되지 않더라도 걱정하지 마십시오.

따라서 펠렛은 여전히 붉은색이겠지만, 상층액은 더 투명해질 것입니다. 이제 상층액을 비우고, 펠렛을 풀어준 뒤, PBS를 50 mL까지 추가하여 원심 분리하고 이 단계를 한 번 더 반복하여 총 두 번의 세척 과정을 거치겠습니다. 그런 다음 세포 수를 측정하겠습니다. 근세포를 두 번 세척한 후 배양액에 현탁시켰으며, 세포 계수기를 사용하여 그 수를 측정하였습니다.

예상했던 결과입니다. 비장 3개에서 약 600 million cells를 얻었는데, 이는 일반적으로 비장 1개당 200 to 250 million cells가 얻어지는 것을 고려하면 예상된 수치입니다. 이제 10% fetal cal serum이 첨가된 배지에 세포를 ml당 2 million cells 농도로 분주하겠습니다.

그리고 해당 배지에 세포를 자극하기 위해 2 µg/mL의 conc A를 첨가하겠습니다. 그 후 세포를 인큐베이터에 넣고 48시간 동안 배양합니다. 이제 세포를 인큐베이터에서 48시간 동안 배양하였으며, 보시는 바와 같이 세포가 상당히 잘 성장했습니다.

배지가 오렌지색으로 변했습니다. 이제 TCGF 준비를 마무리할 준비가 되었습니다. 기억하시겠지만, 세포를 활성화하기 위해 세포 현탁액에 con carnaval을 추가했습니다.

따라서 Concanavalin A는 렉틴입니다. 이것은 T세포의 모든 수용체에 있는 당과 결합하여 해당 세포들을 인위적으로 활성화시킵니다. 현재 문제는 세포 배양 상층액에 여전히 일부 Concanavalin A가 남아 있다는 점입니다.

또한 다른 T 세포 배양에서 세포를 증식시키기 위해 snat를 사용할 예정이므로, 해당 세포 배양물에 con carnaval이 포함되는 것을 원치 않습니다. 따라서 이를 제거하기 위해 con naval in a가 결합하는 과량의 당인 methyl alpha D cyte를 여기에 첨가하겠습니다. 이 당을 과량으로 첨가하여 완전히 용해시키겠습니다.

남아 있는 모든 conc naval이 결합될 것입니다. 그 작업이 완료되면, 세포 상층액을 멸균 여과한 후 향후 몇 주 또는 몇 달 동안 사용할 수 있도록 분주하여 냉동 보관하겠습니다. 이제 마지막 단계를 시작하겠습니다. 세포를 제거하기 위해 원심분리할 수 있도록 세포 배양 상층액을 50 mL 튜브에 넣고 있습니다.

따라서 필요한 만큼 튜브를 채우기만 하면 되며, 이 작업은 배양 후드 안에서 하지 않습니다. 후드 안에서도 가능하지만, 멸균되지 않은 당을 첨가하기 때문에 결국 용액을 여과해야 하므로 단순히 벤치 위에서 수행합니다. 그 편이 더 쉽기 때문입니다. 이제 모든 세포와 상층액을 50 mL falcon 튜브에 부었습니다.

이제 시료를 원심분리기로 가져가 약 10분 동안 원심분리하겠습니다. 원심분리를 하는 유일한 이유는 세포를 펠렛(pellet)화하여 투명한 상층액을 얻기 위해서입니다. 이제 세포가 가라앉아 상층액이 투명해졌으며, 이것이 제가 수집하고자 했던 것입니다.

이제 모든 상층액을 깨끗한 150 square centimeter 플라스크에 수집하겠습니다. 그리고 이 플라스크에 당을 첨가하겠습니다. 세포가 원심분리되는 동안, 상층액 1 ml당 15 milligram이 되도록 필요한 양의 당을 미리 측정해 두었습니다.

완전히 용해될 때까지 기다린 후, 상청액을 멸균 여과하겠습니다. 이제 상청액 1 ml당 15 mg의 당을 첨가하겠습니다. 캡을 다시 닫고, 현재 멸균 조건에서 작업하는 것이 아니므로 용액이 캡에 닿아도 상관없으므로 당이 모두 용해될 때까지 혼합합니다.

시간이 얼마 걸리지 않을 것입니다. 네, 이제 모든 당이 용해되었습니다. 따라서 상층액을 멸균 여과한 후 소분하기만 하면 됩니다.

일반적으로 저는 10~15 $\mu$L씩 소분하여 -20 ${}^\circ\text{C}$에 보관합니다. 이렇게 소분한 시료는 수개월 동안 보관할 수 있습니다. TCGF를 냉장고에 보관할 수도 있지만, 이 경우에는 향후 10~15일 이내에 사용하시기를 권장합니다.

지난 이틀 동안 T세포 성장 인자를 준비하는 방법을 보여드렸으며, 이 상청액은 제조 방법이 매우 간단하고 비용 또한 매우 저렴합니다. 따라서 저희 연구실에서는 고가의 사이토카인 칵테일을 구매하지 않고도 T세포주를 배양 상태로 유지하기 위해 이를 매우 자주 사용합니다. 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.