Ribosome 바운드 Polypeptides을 파악하는 도구로 SecM 체포 시퀀스를 사용하여

이 프로시저의 전반적인 목적은 인 비트로(in vitro) 무세포 시스템에서 번역 중에 생성된 SEC TED 70 s 리보솜 결합 nascent chain complex 또는 RNC를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 관심 유전자의 C-말단에 17개 아미노산 길이의 SEC M 정지 서열을 도입하고, 이를 T7 전사 프로모터 하위에 클로닝함으로써 수행됩니다. 그다음, 인 비트로 전사 반응을 통해 mRNA를 전사한 후 이를 정제합니다.

그 다음, 정제된 mRNA를 방사성 아미노산이 포함된 S 30 E coli 추출 시스템에서 번역하여 합성된 단백질 또는 nascent polypeptide를 표지합니다. 마지막으로, 두 번째 Mr.Ed 리보솜 결합 nascent chain 복합체를 sucrose 밀도 구배 원심분리 및 분획법으로 분리합니다. 최종적으로, 구배 분획에서 분리된 표지된 polypeptide의 젤 전기영동 분석을 통해 nascent chain이 70 s 리보솜에 안정적으로 결합되어 있음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

종결 코돈이 결핍된 mRNA를 사용하는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 번역 및 후속 원심분리 단계 동안 신생 폴리펩타이드 사슬이 70 s 리보솜에 결합하는 것을 매우 효율적으로 보장한다는 점입니다. 또한, 종결 코돈 결핍 기술과 달리, 이 방법은 in vitro 및 in vivo 시스템 모두에서 거의 동일한 효율로 사용될 수 있습니다. 이 방법은 번역 과정 중 어느 시점에 다양한 번역 폴딩 중간체가 형성되는지와 같이 번역 단백질 폴딩 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있으며, 나아가 직접적 또는 간접적 구조 분석을 통해 이들의 구조를 분석하는 데 기여할 수 있습니다.

탐침 및 결정 방법 이 기술은 리보솜에서의 단백질 접힘 경로를 파악하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 프로토콜에서는 70 s 리보솜에 결합된 전체 길이의 bine gamma B 결정성 신생 사슬의 분리 방법을 설명하였습니다. 하지만 이 기술은 사실상 관심 있는 모든 단백질의 다양한 변이체를 분리하는 데 사용될 수 있습니다.

이 전략은 derm Es의 절단된 natin 폴리펩타이드 사슬을 분리하는 데에도 채택될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인은 수크로스 밀도 구배 원심분리 단계에서 어려움을 겪을 수 있습니다. 하지만 숙련된 연구자에게는 문제가 되지 않을 것입니다. 정지 코돈이 결여된 mRNA를 사용한 초기 시도가 성공적이지 않자, 우리는 70S 리보솜에 결합된 gamma B crystalline 신생 폴리펩타이드를 분리하기 위해 두 번째 정지 서열(stalling sequence)을 활용하기로 결정했습니다.

후자의 기술은 SECM 정지 서열을 사용하는 기술만큼의 효율로 이후의 원심분리 단계 동안 RNC의 안정성을 보장할 수 없었습니다. 구배(gradient) 준비 및 RNC 분리 단계는 학습하기 어려울 수 있으며, 재현 가능한 결과를 보장하기 위해서는 일정 수준의 전문 지식이 필요하므로 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 시연은 본 실험실의 대학원생이 수행할 예정입니다. 인비트로(in vitro) 전사와 번역을 수행하기 위해, 먼저 ribosome nascent chain complex 또는 RNC를 생성하기 위해 T7 및/또는 SP6 기반 플라스미드에 클로닝된 관심 유전자부터 시작하십시오.

폴리펩타이드 단편이 리보솜 터널 밖으로 밀려나올 수 있도록 M의 정지 유도 서열(arrest inducing sequence)을 추가하여 표적 폴리펩타이드의 C-말단을 연장합니다. 단백질과 SEC M 정지 서열 사이에 유연한 glycine-serine 풍부 링커를 추가하여 인비트로(in vitro) 전사를 준비합니다. 템플릿 DNA를 선형화하기 위해 오픈 리딩 프레임(open reading frame)의 하류(downstream)를 절단하는 제한 효소를 사용하고, AGOs 겔 전기영동을 실시하여 시료가 완전히 절단되었는지 확인합니다. 최적의 DNA 농도를 확인한 후, 제조사의 지침에 따라 고수율 전사 키트를 사용하여 메신저 RNA를 합성합니다.

염화 리튬 침전법을 사용하여 mRNA를 정제하십시오. 그런 다음 아크릴아마이드 겔 또는 아가로스 겔에서 샘플을 전기영동하여 순도를 확인하십시오. 이는 인비트로(in vitro) 번역을 위한 것입니다.

nuclease free water를 사용한 e coli 시스템에서, methionine이 제외된 1 mM 아미노산 혼합물, 10 units의 ribonuclease inhibitor, 20 µCi의 35S-methionine, 20 µL의 반응 혼합물, 24 µL의 재구성 버퍼 및 24 µL의 e coli Lysate를 첨가합니다. 30 °C에서 5분 동안 배양하여 반응액을 예열합니다. 그 다음 1~2 µg의 mRNA를 첨가하고 30 °C에서 10~15분 동안 추가로 배양합니다.

70 S 리보솜 결합 신생 사슬 복합체(nascent chain complexes, NCs)를 분리하기 위해 반응물을 얼음에 놓아 반응을 정지시킵니다. 20 mM HEPES-KOH (pH 7.5), 15 mM 마그네슘, 100 mM 아세트산 칼륨 및 1 mM DTT가 포함된 5-30% sucrose gradient 4.5 mL 위에 번역 반응액을 층 분리하여 올립니다. 4 °C에서 41,000 RPM으로 2시간 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 프로그래밍 가능 밀도 구배 시스템과 254 nm로 설정된 흡광 검출기를 사용하여 sucrose gradient를 분획합니다.

SEC M 연장 단백질이 70 s 리보솜에 계속 부착되어 있는지 확인하기 위한 추가 분석을 위해 70 s 리보솜이 포함된 분획들을 수집합니다. 각 구배 분획에 트리클로로아세트산을 첨가하여 단백질을 침전시킵니다. 시료를 4°C에서 하룻밤 동안 배양한 후, 다음 날 14,000 ×g에서 15분 동안 원심분리하여 단백질 펠렛을 형성하고, 1 mM tris, HCL pH 7.6과 아세톤을 1:4 비율로 혼합한 용액으로 펠렛을 세척합니다.

펠릿을 공기 중에서 건조시킨 후, SDS page 로딩 버퍼에 다시 현탁합니다. Tris-Tricine SDS page로 샘플을 분리한 다음, 겔을 고정 및 건조시키고 여기에 표시된 대로 자동 방사선 촬영 및 인산화 이미징을 수행합니다. 시험관 내 번역(in vitro translation) 후, gamma B 결정성 단백질이 리보솜에 안정적으로 결합되어 있는지 확인하기 위해 sucrose 밀도 구배 원심분리와 분획법으로 70 S 리보솜을 분리하였습니다.

70 s를 포함하는 분획들을 모아 탈염 및 버퍼 교환을 수행한 후, 추가적으로 수크로스 밀도 구배 원심분리를 실시하였습니다. 여기에 제시된 결과는 SEC M이 gamma B crystalline RNCs의 번역 정지를 효율적으로 유도할 수 있음을 시사합니다. 이 기술은 일단 숙달되면, 대개 하룻밤 동안 TCA 침전 단계가 필요한 신생 사슬의 겔 전기영동 분석을 제외하고는 작업일 기준 하루 만에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때, 모든 단계에서 RNA 오염을 방지하는 것이 매우 중요합니다. RNA 오염은 추출물의 번역 효율에 영향을 미칠 수 있으며, 70S 리보솜으로부터 신생 폴리펩타이드의 방출을 유도할 수 있습니다. 이 절차를 통해 최종 목적에 따라 70S 리보솜에 안정적으로 결합된 NAST 및 미리 정해진 길이의 폴리펩타이드를 얻을 수 있습니다.

이 복합체는 NMR 또는 FRET과 같은 직접 및 간접적인 접근 방식을 통한 리보솜 결합 신생 사슬(nascent chains)의 구조 결정이나, 개발 후 인자와 리간드의 결합 테스트 등 다양한 목적으로 활용될 수 있습니다. 이 기술은 구조 생물학 및 단백질 접힘 분야의 연구자들이 리보솜에 결합된 전장 단백질의 구조뿐만 아니라 공번역 접힘 중간체(cotranslational folding intermediates)를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 번역 단백질 접힘 분야의 다양한 질문에 답하는 데 활용할 수 있도록 70S 리보솜에 안정적으로 결합된 신생 폴리펩타이드를 준비하고 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

방사성 동위원소 및 ${}^{35}\text{S}$ 메티오닌과 같은 표지 아미노산을 다룰 때는 특별한 주의가 필요하며, 본 실험 절차를 수행하는 동안 항상 이를 고려해야 함을 잊지 마십시오.