인간의 췌장을위한 컬렉션 프로토콜

이 절차의 전체적인 목적은 해부학적 방향성을 유지하는 방식으로 인간의 췌장을 박리하는 것입니다. 이는 췌장에서 십이지장과 비장을 제거한 후, 췌장의 과도한 지방과 혈관을 정리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 췌장의 전면을 파란색 잉크로, 후면을 검은색 잉크로 칠하는 것입니다.

다음으로, 췌장을 세 영역으로 나눕니다. 그런 다음 각 영역을 가로 방향으로 균등한 두께의 조각으로 절단하여 파라핀 카세트나 OCT 몰드에 넣거나, 더 잘게 다져 바이알에 넣습니다. 최종적으로 췌장의 세 영역 모두에서 샘플을 수집하며, 이때 향후 분석을 위해 정확한 해부학적 방향을 유지합니다.

이 방법은 베타 세포 질량 또는 기능의 손실 기전, 그리고 면역 세포 공격의 특성과 같이 제1형 당뇨병 연구의 핵심 질문들을 해결하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 췌장의 생체 내 방향을 유지하려면 세부 사항에 주의를 기울여야 하므로, 췌장 처리 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 본 절차의 시연은 저희 실험실의 조직 기술자인 Linda Snyder와 생물학자인 Emily Montgomery가 진행하겠습니다.

절차에 필요한 모든 재료를 준비하는 것으로 시작하십시오. 먼저, 파라핀 블록을 담을 카세트에 공여자 식별자, 시료 유형, 분주 번호 및 기타 추가 정보를 기입하십시오. 다음으로, OCT 몰드에도 동일한 방식으로 라벨을 붙이십시오.

각 OCT 블록을 감쌀 수 있는 충분한 양의 알루미늄 호일을 잘라 나중에 사용할 수 있도록 준비해 둡니다. 신선한 샘플과 냉동 샘플을 보관하는 데 필요한 모든 바이알을 준비합니다. 적절한 시점에 RNA later와 RPMI 배지를 첨가합니다.

다음으로, 생물안전 작업대(biosafety hood)와 실험대 위에 해부판, 멸균된 기구 및 절차에 필요한 모든 기타 소모품을 배치하여 작업 영역을 준비합니다. 모든 카세트와 OCT 몰드를 사용 순서대로 근처에 정렬해 둡니다. 스티로폼 박스 바닥의 드라이아이스가 충분히 덮일 정도로 이소펜탄(isopentane)을 추가하여 냉동조(freezing bath)를 만듭니다.

해부를 시작하려면 십이지장과 비장을 제거하십시오. 한쪽 끝에서부터 십이지장과 췌장을 분리하기 시작하여 완전히 떨어질 때까지 계속합니다. 비장은 느슨하게 부착되어 있어 지방과 췌장에서 쉽게 제거할 수 있습니다.

다음으로, 둔성 및 예리한 박리법을 병행하여 췌장에서 불필요한 지방, 혈관 및 신경을 제거합니다. 제거한 지방과 림프절은 나중에 처리할 수 있도록 따로 보관합니다. 세척이 완료되면, 종이 타월이 깔린 박리판 위에 췌장을 놓습니다.

췌장의 올바른 방향을 유지하는 것이 이 실험 절차에서 가장 어려운 부분입니다. 성공적인 수행을 위해 췌장의 전면과 후면을 서로 다른 색상의 잉크로 표시합니다. 면봉을 파란색 잉크에 담가 췌장의 전면에 펴 바른 후, 과도한 잉크는 닦아냅니다.

다음으로, 새로운 어플리케이터를 검은색 잉크에 담근 후 췌장의 후면에 펴 바릅니다. 췌장을 원래 방향으로 되돌립니다. 전면이 위를 향하게 하여 췌장을 세 부분으로 절단할 준비를 마칩니다.

먼저, 머리와 몸통 사이의 접합부를 절단합니다. 다음으로, 남은 부분을 거의 동일한 크기로 나누어 몸통과 꼬리를 분리한 후, 췌장 각 부위의 무게를 기록합니다. 머리 부분부터 시작하십시오.

식빵을 자르는 것과 유사하게 횡단면으로 절단하여 각 부위를 약 0.5 centimeter 간격의 섹션으로 나눕니다. 췌장의 각 부위를 슬라이스한 후, 머리 부위의 마지막 섹션인 머리-몸통 접합부 섹션을 제거하여 별도의 해부판에 놓습니다. 이 섹션을 작은 조각으로 잘게 다진 후, RNA 포함 여부가 표시된 크라이오 바이알에 조각들을 균등하게 나누어 넣습니다.

그 후, 바이알을 동결합니다. 표준 절차를 따르십시오. 몸통-꼬리 접합부 섹션에 대해 이 과정을 반복합니다.

다져진 샘플 수집이 완료되면, 모든 횡단면을 오른쪽으로 기울입니다. 각 영역의 단면을 하나씩 건너뛰며 제거합니다. 파라핀 및 OCT 블록의 경우, 파라핀 블로킹을 위해 첫 번째 단면을 제거합니다.

섹션이 너무 크면 절반으로 자릅니다. 카세트에 A와 B라고 표시합니다. 조각이 여전히 너무 크다면, 각 섹션을 이전 절단면과 수직이 되게 자른 다음 카세트에 시계 방향으로 A부터 D까지 표시합니다. 여기에서 보는 것처럼, 라벨이 왼쪽에 오도록 카세트를 배치하십시오.

다음으로, 조직을 카세트에 넣고 뚜껑을 닫습니다. 카세트를 중성 완충 포르말린이 담긴 용기로 옮깁니다. OCT 블록의 경우 가장 내측 섹션부터 시작하여 각 영역 내에서 블록에 순차적으로 번호를 매깁니다.

미리 라벨을 붙인 몰드에 OCT 매질을 얇게 붓습니다. 조직을 넣기 전에 조직을 OCT 매질로 덮고, 나중에 사용하기 위해 샘플을 빠르게 동결시킨 후 이전에 따로 떼어 놓은 조직으로 돌아갑니다. 림프절 캡슐 주변의 지방과 결합 조직을 다듬어 제거하여 췌장 림프절을 분리합니다. 림프절을 DMEF가 담긴 멸균 접시에 넣고, 큰 림프절은 0.5 cm 이하의 크기로 잘게 다집니다.

췌장 림프절을 분리한 후, 추가 처리를 위해 준비된 바이알과 카세트에 조직을 나누어 담습니다. 림프절 처리를 마친 후, 비장을 잘게 다져 비슷한 방식으로 보관합니다. 십이지장을 처리하려면, 젖은 거즈 패드로 점막의 점액을 닦아내고 점막을 잘라낸 다음, 이를 여러 구역으로 절단합니다.

앞서 설명한 대로 점막 샘플을 나눕니다. 이 절차를 통해 여기에서 보는 것과 같이 췌장 각 부위의 대표 샘플을 수집합니다. 머리, 몸통 및 꼬리 부위의 무게는 거의 동일했습니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 인체 췌장을 다양한 샘플 유형으로 처리하는 방법, 특히 방향성을 유지하는 방법과 췌장 주변 지방에서 림프절을 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.