마우스 소장에서 돌기 세포 및 Macrophages의 분리 및 특성화

이 프로시저의 전체적인 목표는 표현형 및 기능적 특성 분석을 위해 마우스의 장 dendritic cells(dcs) 및 대식세포를 신속하게 분리하는 것입니다. 이는 먼저 장 조직을 수확함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 장 상피를 고유층(lamina propria)으로부터 분리하는 것입니다.

다음으로, 절차의 마지막 단계에서 장 고유층(Lamin Propria)을 소화합니다. 고유층 세포를 형광 표지된 접합 항체로 염색하고, 특정 세포군을 분류하기 위해 게이팅(gating)합니다. 최종적으로 장 수지상세포(DC) 및 대식세포군을 더욱 정확하게 특성화하고 정제하여, 사이토카인 생성, 항원 제시 및 면역 세포 조절을 평가하는 기능 연구에 활용할 수 있습니다.

이 기술이 기존 방법보다 갖는 주요 장점은 조직 소화 속도가 매우 빨라 세포 표면 항원 발현, 세포 생존력 및 세포 상태를 최적으로 유지할 수 있다는 것입니다. 마우스를 안락사시킨 후 발가락 집기 반사로 사망을 확인하고, 동물의 복부와 흉부에 70%ethanol을 분무하십시오. 그런 다음 가위를 사용하여 복부 중앙에 작은 가로 절개를 넣고 피부를 젖혀 복막을 노출시킵니다.

유문 괄약근 부위를 절개하여 위와 상부 소장을 분리하고, 포셉을 사용하여 장간막을 떼어낸 후 가위로 복막을 엽니다. 회맹판 부위를 다시 절개하여 소장 전체를 대장에서 분리합니다. 대장에서 장간막을 계속해서 분리하고 항문 입구 쪽을 절개합니다.

가위로 결장을 세로 방향으로 절개하고, 상온의 C-M-F-P-B-S를 사용하여 장관 내강의 분변 내용물과 점액을 세척해 냅니다. 그런 다음 가위와 핀셋을 사용하여 소장의 장간막 반대쪽 표면을 따라 파이어 패치(pyres patches)를 육안으로 확인하며 분리하고, 소장을 세로 방향으로 절개합니다.

다음으로, 실온의 C-M-F-P-B-S를 더 사용하여 소장 내강의 분변 내용물과 점액을 제거합니다. 별도로 소장과 대장을 약 1.5 centimeter 길이로 자르고, 각 조각을 FBS와 2 millimolar EDTA가 포함된 30 milliliter의 예열된 C-M-F-H-B-S-S가 들어 있는 개별 50 milliliter 원심분리 튜브에 넣습니다. 각 50 milliliter 원심분리 튜브를 오비탈 쉐이커에 수평으로 배치하고 37 degrees Celsius에서 20분 동안 250 RPM으로 흔들어 줍니다.

다음으로 폐액 버킷 위에 메쉬 와이어 스트레이너를 하나 놓습니다. 각 50 milliliter 원뿔형 튜브의 내용물을 메쉬에 부어 장 조각들을 회수하고, 이를 2 millimolar EDTA가 포함된 FBS 함유 Prewarm C-M-F-H-B-S-S 30 milliliters가 들어 있는 새로운 개별 50 milliliter 원뿔형 튜브에 넣습니다. 마지막으로, 튜브들을 다시 오비탈 쉐이커에 넣고 20분 동안 더 반응시킵니다.

두 번째 흔들기 단계가 끝난 후, 각 튜브의 내용물을 체에 걸러 붓습니다. 다시 한번 종이 타월을 사용하여 과도한 배지를 닦아낸 다음, 장 조각들을 작은 플라스틱 유청 보트(whey boat)로 옮깁니다. 이 기술에서 가장 어려운 부분은 조직 소화 과정이며, 성공적인 결과를 얻기 위해서는 소화 시간, 콜라게나제(collagenase)의 특성, 조직의 무결성 및 소화할 조직의 크기와 같은 모든 다양한 매개변수를 가위로 신속하게 처리하며 고려해야 합니다.

장 조각들을 잘게 자른 다음, 다져진 장 조직을 20 mL의 collagenase 용액이 들어 있는 50 mm 원뿔형 튜브에 넣습니다. 원뿔형 튜브를 궤도 셰이커(orbital shaker)에 수평으로 배치하고, 37 °C에서 200 RPM으로 10분에서 20분 동안 장 조각들을 소화시킵니다. 이제 튜브를 짧게 볼텍싱(vortex)하여 남아 있는 장 조직이 완전히 해리되도록 한 다음, 세포 슬러리를 100 µm 세포 스트레이너로 걸러 50 mL 원뿔형 튜브에 직접 담습니다.

마지막으로, 원추형 튜브의 빈 공간을 FBS가 포함된 C-M-F-H-B-S-S로 채우고, 세포 용액을 4 °C에서 425 ×g로 5분 동안 두 번 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 따라내고 세포 펠릿을 얼음처럼 차가운 FBS 포함 C-M-F-H-B-S-S에 다시 현탁하여 샘플을 얼음에 둡니다. 이후 관심 있는 세포 표면 단백질에 대해 세포를 염색합니다.

여기에 표시된 것과 같이 사멸 세포 염색 양성 세포를 제외하여 도트 플롯(dot plot)을 생성하는 것으로 시작하십시오. 다음으로, 여기와 여기에 표시된 대로 더블렛(doublet) 이벤트를 제외하십시오. 이제 전방 산란광(forward scatter)과 측방 산란광(side scatter) 채널을 사용하여 파편(debris)을 반드시 제외하고 분석 대상 세포를 게이팅(gate)하십시오.

그런 다음 CD 45 양성과 IAB 양성 항원 제시 세포를 게이팅하여 또 다른 점 도표(dot plot)를 생성합니다. 별도의 점 도표에서 특정 DC 및 대식세포 서브셋을 구분하기 위한 영역을 설정합니다. 여기에서 표시된 R1 영역은 CD 11 C 양성 및 CD 11 B dull 음성 세포를 포착합니다.

R2 영역은 R1 영역의 세포들과 유사한 수준의 CD11C 표면 발현을 보이지만, 동시에 CD11B를 발현하는 세포들을 나타냅니다. R3 영역은 CD11B 양성이면서 CD11C 약음성(dull negative)인 세포들을 지정합니다. 이 세 영역은 각각 대식세포와 수지상세포(DC) 집단을 구분하기 위해 F4/80 및 CD103 발현을 추가로 분석할 수 있습니다. 이 도트 플롯에서 볼 수 있듯이, R1 영역의 CD11C 양성 CD11B 약음성 세포들은 높은 수준의 αE CD103과 낮은 수준의 F4/80을 발현할 것입니다.

이 도트 플롯(dot plot)은 R2 영역의 CD11b 양성 CD11c 양성 세포가 CD103과 F4/80의 이분법적 발현을 바탕으로 DC와 대식세포 모두로 구성됨을 보여줍니다. 마지막으로, F4/80 양성 및 CD103 음성 표현형 프로파일인 R3를 바탕으로, 게이팅된 CD11b 양성 CD11c 델타 음성 세포는 대식세포로 구성됩니다. 조직 소화 시간과 총 세포 수율, 그리고 CD11b 및 CD11c 발현 사이의 관계는 다음 6개 그림에 나타나 있습니다. 3분 동안 소화한 장 조직은 총 세포 수가 적어 특성 분석에 사용할 수 있는 DC와 대식세포가 거의 없습니다. 11분 동안 조직을 소화하면 살아있는 세포가 충분히 수득되며, CD11b와 CD11c를 높게 발현하고 표현형적으로 뚜렷이 구분되는 DC 및 대식세포 집단을 얻을 수 있습니다.

반면, 50분 동안 소화시키면 최적화된 소화 과정과 유사한 세포 회수율을 얻을 수 있습니다. 하지만 CD 11 B와 CD 11 C를 이용한 서로 다른 세포 군집의 구분이 더 어려워집니다. 이는 CD 11 C의 발현이 감소하고 사멸 세포의 수가 증가하기 때문입니다.

따라서 장 조직 소화를 위한 파라미터를 최적화함으로써, 견고한 세포 수율을 신속하게 얻을 수 있습니다. 결과적으로, 마우스 장 내 DC와 대식세포를 빠르게 분리하는 방법은 표면 항원이 온전하게 보존된 면역 세포의 기능적 특성을 평가하는 데 유용할 수 있습니다.