인간의 세포에서 분비 단백질의 생산을위한 편리하고 일반적인 표현 플랫폼

본 영상에서는 HEK 293T 세포로부터 분비 단백질을 발현시키기 위한 시간 및 비용 효율적인 절차를 설명합니다. 우선, 6-well 플레이트에 40% 합류도를 갖는 HEK 293T 세포 배양액을 준비합니다. 그 다음, 무혈청 배지에서 GeneJuice와 테스트 플라스미드를 희석하여 transfection 혼합물을 제조합니다.

형질전환 혼합물을 세포 위에 분주하고, 단백질 발현을 위해 37 °C에서 배양합니다. 상층액 내 단백질 검출은 western blot을 통해 수행할 수 있습니다. 적절한 컨스트럭트가 확인되면, 10층 세포 공장(cell factory)을 사용하여 공정을 확장할 수 있습니다.

PEI를 transfection 시약으로 사용하여 세포를 transfection합니다. 접선 유동 여과(tangential flow filtration) 후 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 통해 배양 상청액에서 단백질을 수확할 수 있습니다. 궁극적으로, 이 플랫폼을 통해 광범위한 거대분자를 밀리그램 단위의 양으로 발현시킬 수 있습니다.

이 기술이 balo virus 기반 곤충 세포 발현과 같은 기존 방법보다 갖는 주요 장점은, 수많은 컨스트럭트를 스크리닝하고 발현을 위해 스케일업 할 수 있으며, 단 3주 만에 결과를 얻을 수 있다는 점입니다. 이 절차의 시연은 제 연구실의 대학원생 세 명인 Hello Aiden, Shada Zini, Jonathan Cook이 진행하겠습니다. 먼저 6-웰 플레이트의 웰당 1 mL 부피에 HEC 2 9 3 T 세포 250,000개를 분주하는 것으로 시작합니다. 웰당 10% FBS와 pentre가 보충된 DMEM 1 mL를 추가하고, 플레이트를 흔들어 세포를 고르게 분산시킵니다.

그런 다음 37°C의 습윤한 5% 이산화탄소 배양기에서 세포를 하룻밤 동안 배양합니다. 세포의 합류도가 약 40%에 도달하면, transfection 혼합물을 준비하기 위해 상층액을 2 mL의 신선한 배지로 교체합니다. 먼저 90 µL의 무혈청 DMEM을 원심분리 튜브에 분주합니다.

그런 다음 transfection 시약인 gene juice 3 µL를 첨가하고 튜브의 내용물을 부드럽게 혼합한 후 상온에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, transfection할 mini prep 정제 plasmid DNA의 100 ng/µL 스톡액 10 µL를 첨가합니다.

튜브의 내용물을 혼합하고 실온에서 15분 동안 방치합니다. transfection을 수행하려면 혼합물을 HEC 2 9 3 T 세포 위에 분주합니다. transfection 혼합물이 균일하게 퍼지도록 플레이트를 부드럽게 흔들며 한 방울씩 떨어뜨립니다.

그 다음 세포를 37°C에서 배양합니다. 24시간 후에 각 웰에 1 mL의 신선한 배지를 추가하고 48시간 동안 더 배양합니다. 형질전환 3일 후, 상층액을 수확하고 웨스턴 블롯을 통해 표적 단백질의 발현 수준을 검출합니다.

적절한 컨스트럭트(construct)가 확인되면, 트랜스펙션(transfection) 절차의 규모를 확대할 수 있습니다. 10층 셀 팩토리(cell factory)를 사용하여, 5% FBS가 보충된 DMEM 1.2리터를 셀 팩토리에 채웁니다. 그런 다음 2억 개의 HEC 2 9 3 T 세포를 모든 층에 균일하게 분산시켜 추가합니다.

100% 밀도로 배양된 225 cm² T-플라스크 4개에는 약 2억 개의 세포가 포함되어 있습니다. 세포를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 840 µg의 DNA를 84 mL의 멸균 1× PBS에 희석하여 T 75 플라스크에 transfection 혼합물을 준비하십시오.

1 mg/mL 농도의 폴리에틸렌이민(polyethylene imine) 용액 또는 PEI 2.5 milliliters를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15분 동안 배양합니다. 용액이 탁해져야 합니다. 다음으로, 트랜스펙션 혼합물을 셀 팩토리(cell factory)에 천천히 붓고 골고루 분산시킵니다.

전체 층. 최종 농도가 4 mM이 되도록 발프로산(valproic acid)을 첨가합니다. 이는 트랜스펙션 혼합물을 첨가한 후 발현 수율을 높여줍니다.

단백질 발현을 위해 배양물을 37 °C에서 4일 동안 배양합니다. transfection 후 4일째에 배지를 수확하고, 재사용을 위해 즉시 cell factory를 세척합니다. 수집한 배지를 4 °C에서 6,000 G로 30분 동안 원심 분리하고, 0.22 micron steric cup vacuum filter 장치를 통해 여과하여 모든 입자성 물질을 제거합니다. 그런 다음 centra mate tangential flow filtration 시스템을 사용하여 상층액을 75 mL로 농축합니다.

상층액을 농축한 후, 친화성 크로마토그래피를 통해 목적 단백질을 정제할 수 있습니다. 본 실험에서는 여기에 기술된 대규모 시스템을 사용하여 인간 AAL two 수용체 세포외 도메인의 HA 태그 부착 서브유닛을 정제하였으며, 이어서 고친화성 anti-HA 크로마토그래피를 수행하였습니다. 이는 쿠마시 블루로 염색된 SDS-PAGE 분석 결과에서 확인할 수 있습니다.

인터루킨 2 수용체 알파 및 감마 서브유닛의 세포외 도메인은 각각 40 kilodaltons 및 46 kilodaltons의 분자량으로 이동합니다. IL two R alpha 및 IL two R gamma에 존재하는 EnLink 글리칸의 불균일성으로 인해 SDS page 젤에서 밴드 확장 현상이 나타났습니다. 더 높은 분자량의 밴드는 오염된 BSA를 나타냅니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 10층 셀 팩토리를 사용하여 인간 세포 배양으로부터 단백질을 발현시키는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. HEK 293 T 세포는 생물학적 위험 물질로 간주되므로 생물안전등급 2(biosafety level two)에서 취급해야 함을 잊지 마십시오. 항상 적절한 개인 보호 장구를 착용해야 하며, 표면 소독은 기관 및 정부 지침에 따라 수행해야 합니다.