신진 대사 레이블 및 유동세포계측법와 세포주기 진행의 동력학 측정

다음 절차의 전반적인 목표는 세포 주기 속도와 진행 과정을 측정하는 것입니다. 먼저 세포를 romo, deoxy, uridine 또는 BRDU로 펄스-체이스 표지하며, 이는 티미딘 대신 세포의 DNA에 통합됩니다. 그 다음, BRDU에 대한 항체로 세포를 면역 염색하고 염색 직후 유세포 분석기로 분석합니다.

표지된 세포들이 세포 주기를 거쳐 G2기로 진행함에 따라 S기 세포만이 표지됩니다. 이들은 유사 분열 후 4N DNA 함량을 가진 것으로 검출됩니다. 그 후 DNA 함량은 2N으로 감소합니다. 따라서 유세포 분석을 통해 생성된 형광 프로파일 분석을 통해 세포 주기 진행의 역학을 결정할 수 있습니다.

세포 동기화를 위해 화학 물질을 사용하는 다른 프로토콜과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 세포 분열 기전에 의도치 않게 영향을 줄 수 있는 생리학적 섭동이 없다는 점입니다. 저희는 화학적 동기화를 이용해 세포 주기 진행 속도를 연구하려 했을 때 분석을 방해하는 예상치 못한 결과가 나타나면서 처음으로 이 방법을 도입하게 되었습니다. 이 방법은 세포 생물학 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.

예를 들어, 서로 다른 세포 유형 간의 성장 속도 차이가 발생하는 근거는 무엇일까요? 이를 확인하기 위해 BRDU를 이용한 펄스-체이스 표지법(pulse Chase labeling)으로 본 프로토콜을 시작하십시오. 각 시점당 하나의 10 centimeter 플레이트와 다음의 각 대조군당 하나의 플레이트를 준비하여 표지를 시작하십시오.

BRDU 전용, PI 전용, BRDU 음성, PI 음성. 각 플레이트에 5 × 10⁵개의 MCF-7 세포를 보충된 DMEM에 분주합니다. 세포가 회복되고 부착될 수 있도록 플레이트를 24~48시간 동안 배양합니다. 세포 밀도가 60%에 도달하면, 배지를 10 µM이 포함된 신선한 DMEM으로 교체합니다.

BrdU를 첨가하여 세포를 37°C, 5% CO2 조건에서 1시간 동안 배양해 DNA에 BrdU가 통합되도록 합니다. 1시간 후, 음성 대조군 또는 0시간 시점으로 사용할 플레이트 하나는 처리하지 않은 상태로 남겨두어야 합니다. 펄스 라벨링 배지를 제거하고 PBS로 세포를 짧게 헹군 후, 2~8시간 시간대의 실험을 진행합니다.

신선한 성장 배지를 추가하고 배양기로 다시 넣습니다. 그 후 다음 섹션에서 설명하는 대로 0시간 및 1시간 시점의 플레이트를 즉시 수확합니다. 세포를 수확하려면 배지를 흡입하고 플레이트를 헹굽니다.

PBS로 한 번 세척한 후, 트립신을 처리하여 세포를 플레이트에서 떼어내고 DMEM에 수집하여 390 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거합니다. 그 후 1~5 mL의 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 헹구고 390 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 세포를 100 µL의 얼음에 재부유시킵니다.

1% FBS가 포함된 차가운 PBS입니다. FBS는 세포 응집을 방지하는 역할을 합니다. 이 과정에서 가장 중요한 사항 중 하나는 수확한 세포로부터 단일 세포 현탁액을 확보하는 것입니다.

사실 관계 확인을 위해, 세포를 에탄올에 한 방울씩 직접 추가하여 이를 달성할 수 있습니다. 이는 매우 중요한 단계입니다. 다음으로 세포를 고정하기 위해, 피펫을 사용하여 세포를 5 mL의 ice code에 한 방울씩 추가하십시오.

15 mL 원심 분리 튜브에 70% 에탄올을 넣습니다. 세포를 얼음 위에서 30분 동안 배양하거나 4°C에서 하룻밤 동안 보관합니다. 이 단계는 다양한 시점에서 수집한 샘플의 수집을 중단하기에 이상적인 단계이며, 샘플을 에탄올에 며칠 동안 보관할 수 있어 BRDU 및 propidium iodide 염색을 위해 나머지 프로토콜 과정을 동시에 진행할 수 있습니다.

4°C에서 세포를 꺼내 90 ×g에서 5분 동안 3회 원심분리합니다. 원심분리 후 고정액의 대부분을 흡입하여 약 50 µL만 남깁니다. 그 후 보텍싱합니다.

Vortexing을 통해 DNA를 변성시키면서 펠릿을 풀어줍니다. 2 N HCL Triton X 100 1 mL를 천천히 한 방울씩 첨가한 후, 상온에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 3,090 ×g에서 5분간 원심분리하여 세포를 펠릿화한 다음, 상층액을 흡입하여 제거합니다.

그런 다음 세포 펠렛을 0.1 M sodium tetra borate 1 mL에 다시 현탁합니다. 원심분리 후, 세포를 다시 흡입하여 상층액을 제거합니다. 그 후 세포 펠렛을 75 µL의 BRDU 염색액에 다시 현탁합니다.

빛을 차단한 상태로 실온에서 45분 동안 혼합 배양합니다. 이전과 동일하게 원심분리를 통해 세포를 펠렛화하고, 5 µg/mL의 propidium iodide가 포함된 PBS 1 mL에 세포 펠렛을 재현탁합니다. PI 양성 샘플을 유세포 분석기로 분석할 때, 세포의 적절한 크기 분포를 확인하기 위해 전방 산란광(forward scatter) 대 측방 산란광(side scatter) 플롯을 생성합니다.

이 두 파라미터 모두 선형 스케일로 도식화해야 합니다. 동시에 FL three H 대 FL two W의 플롯을 확인하여 PI 염색 정도와 형광 펄스 폭을 관찰하십시오. 이 플롯은 세포 주기 내의 정상적인 분포 패턴에 있다고 판단되는 세포 분획을 분리하기 위한 게이트를 설정하는 데 사용됩니다.

일반적으로 이러한 분포 양상은 각각 세포 주기의 G1기와 G2기를 나타내는 2N 및 4N의 PI 염색 DNA 함량을 가진 두 개의 세포 군집으로 특징지어집니다. 이 두 군집 사이에 위치한 세포열은 세포 주기의 S기에서 발생하는 지속적인 DNA 복제를 나타냅니다. Y축에는 log 스케일의 FL1-H 또는 FITC를, X축에는 linear 스케일의 PI를 표시하여 게이팅된 세포들을 나타내는 플롯을 생성하십시오.

이 플롯은 다양한 컨트롤을 사용하여 나머지 파라미터를 설정하고 데이터를 수집하는 데 사용됩니다. 분석을 위해 PI 단독 염색 샘플을 유세포 분석기의 로딩 포트에 넣고, x축의 G1 값이 약 200에 위치하도록 게인을 조정하십시오. 이는 PI 염색의 히스토그램 플롯으로 시각화하면 더 쉽게 확인할 수 있습니다.

다음으로 BRDU 단독 시료를 로딩 포트에 넣고 실행합니다. BRDU 양성과 BRDU 음성의 두 세포군이 플롯에 나타나도록 게인을 조절하십시오. 이상적으로는 BRDU 음성 세포가 10¹ 바로 위 또는 아래에 위치해야 합니다.

마지막 대조군은 BDU/PI 음성 샘플입니다. 이 음성 대조군을 실행하여 세포가 상단 또는 우측 사분면 어디에도 나타나지 않는지 확인하십시오. 다양한 플롯의 파라미터 설정이 완료되면, 유세포 분석기의 보정이 마무리되어 BrDU 및 PI 염색 세포의 처리를 위한 준비가 완료됩니다. 각 샘플당 최소 10,000개의 PI 게이트 세포로부터 데이터를 수집합니다.

그다음 FlowJo 또는 fax diva와 같은 소프트웨어를 사용하여, PI versus FL two W 플롯에서 PI 양성으로 게이팅된 세포를 대상으로 FITC 대 PI 플롯을 생성하여 주기 세포군을 구분합니다. 이어서, BRDU 양성 세포군을 분리하기 위해 두 번째 게이트를 생성합니다.

그 다음, 세포 주기 진행의 시간 경과를 추적하기 위해, G1 또는 G2 함량을 가진 BrdU 양성 세포 수를 시간의 함수로 도식화하여 두 대장암 세포주 HT 29와 LS 180 간의 세포 주기 진행 역학을 비교합니다. 세포는 BrdU 펄스 제거 후 8시간 동안 매시간 수집되었습니다.

두 프로파일의 키네틱을 비교하면, BRDU 처리 후 t=4시간 시점에서 LS 180 세포에서는 G1 피크의 출현이 뚜렷하게 나타나는 반면, 해당 시점의 HT 29 세포주에서는 이 피크가 나타나지 않습니다. 이는 세포 주기 G2 단계를 거치는 세포 주기 진행이 가속화되었음을 나타냅니다. 유방암 세포주의 주기 프로파일을 생성하기 위해 대장암 세포주 LS 180을 사용하였습니다.

MC seven 세포를 8시간 동안 매시간 수집하였습니다. BRDU 펄스를 제거한 후, 면역 표지 및 DNA 대조 염색된 세포들을 형광 신호에 따라 분류하였습니다.

여기서 볼 수 있듯이, CF seven 세포는 테스트한 두 대장암 세포주보다 훨씬 느린 속도로 주기 회전을 했습니다. 이 영상을 시청함으로써, 시점별 수확과 병행한 DNA의 대사 표지가 어떻게 세포 주기 역학을 추적할 수 있게 하는지 충분히 이해하셨을 것입니다.