암 생체 현지화위한 작은 동물의 계산된 Tomography 주 도형 시간 도메인 미만성 형광 Tomography

다음 실험의 전체적인 목표는 정위성 교모세포종 마우스 모델에서 상피 성장 인자 수용체 발현의 형광 이미지를 생성하는 것입니다. 이는 A IIC 마우스의 좌측 대뇌 반구에 녹색 형광 단백질을 발현하는 인간 U2 51 교모세포종 세포를 접종함으로써 달성됩니다. 종양이 2주 동안 성장한 후, 마우스에 두 가지 형광 추적자로 구성된 칵테일을 주입합니다.

그 다음, 정확한 영상 재구성(image reconstruction)에 필요한 해부학적 데이터를 수집하기 위해 소동물 X선 시스템으로 마우스를 촬영합니다. 이 데이터는 광학 단층 촬영 시스템의 광원과 검출기 위치를 해부학적으로 배치하는 데 사용되며, 맞춤형 소프트웨어를 이용해 형광 데이터를 수집하고 최종 영상을 구축합니다. 궁극적으로, 이 방법은 형광 및 X선 영상을 모두 활용하여 표피성장인자(epidermal growth factor)의 과발현을 기반으로 종양 영상을 구축할 수 있으며, 그 정확도는 조영 증강 자기공명영상(contrast enhanced magnetic resonance imaging)과 비교하여 검증할 수 있습니다.

전하결합소자(CCD) 기반의 소동물 형광 단층촬영과 같은 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은 광전증배관을 이용한 단일 광자 계수 검출을 통해 빛 검출에 있어 훨씬 더 높은 민감도와 다이내믹 레인지를 제공한다는 것입니다. 이 방법은 궁극적으로 표적의 발현을 측정함으로써 분자 치료의 성공 여부를 모니터링하고 평가하는 데 사용될 수 있습니다. 피하 종양은 표면 이미징을 이용한 비단층촬영 방식으로 쉽게 촬영할 수 있지만, 본 시스템은 최대 수 센티미터 두께의 조직을 투과하여 이미징할 수 있도록 설계되어 뇌종양 내 조영제 전달 및 누출을 이미징하는 데 특히 적합합니다.

이 방법은 암 바이오마커 발현에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 감염이나 비만과 같은 다른 질환 연구 또는 알츠하이머와 같은 노화 관련 요소 연구에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 생체 조직 내 빛 전파의 확산 특성과 확산광 재구성을 위한 X선 단층촬영 활용의 어려움으로 인해 고전할 수 있습니다. 따라서 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다.

데이터 수집 및 이미지 재구성 단계는 습득하기 어려울 수 있으므로, 형광 시스템에서 수집된 데이터가 적절히 보정되었는지 확인하는 것이 중요합니다. near fast 소프트웨어 패키지는 광학 데이터를 읽어 들여 X선 단층 촬영 이미지를 통해 유한 요소 메쉬를 생성하도록 설계되었으며, 이는 형광 재구성을 위한 공간 템플릿으로 사용됩니다. 먼저 마취된 무삭모(athymic nude) 마우스를 멸균 수술 포 위에 놓고, 진행하기 전에 마취 깊이를 확인한 후 절개 부위의 피부를 세척하고 소독하십시오.

Betadine을 사용하여 절개 부위 위에 멸균 수술 포를 덮습니다. 메스를 사용하여 정중선에서 약간 왼쪽, 안구 내 라인에서 뒤쪽으로 0.5 centimeters 지점에 작은 절개를 가합니다. 지표를 확인할 수 있도록 결합 조직을 제거하여 두개골 표면을 깨끗이 닦아냅니다. 두개골이 노출되면, 멸균된 1 millimeter 비트가 장착된 고속 드릴을 사용하여 중앙선에서 왼쪽으로 2 millimeters, bgma에서 뒤쪽으로 2 millimeters 지점에 구멍을 뚫습니다.

이식할 세포를 27 gauge 둔단 바늘(blunt ended needle)이 장착된 Hamilton Micros 주사기에 충전합니다. 다음으로, 마우스를 정위 고정틀(stereotaxic frame)에 배치합니다. 그 후 발가락 꼬집기(toe pinch)를 통해 깊은 수술 및 미용 마취 단계에 진입했는지 확인하고, 동물에게 수술용 드레이프를 다시 덮어줍니다.

다음으로, 시약을 충전한 주사기를 정위 고정 틀(stereotaxic frame)에 고정합니다. 두개골의 구멍 위에 주사기를 위치시키고, 바늘 끝을 두개골 표면에서 3 mm 아래로 삽입합니다. 그 다음, 바늘을 1 mm 뒤로 빼서 포켓을 생성합니다.

다음 단계는 5분에 걸쳐 세포를 좌측 대뇌 반구에 천천히 주입하는 것입니다. 주입이 완료되면 바늘을 제거하고 구멍을 Betadine으로 닦아냅니다. 세포가 주입 부위 외로 성장하는 것을 방지하기 위해, 마우스를 정위 고정 장치에서 분리하고 노출된 구멍을 미리 데워둔 bone wax로 채웁니다.

마지막으로, 멸균된 5-0 나일론 봉합사로 절개 부위를 봉합합니다. 마우스를 가온 케이지로 옮기고 회복될 때까지 모니터링합니다. 회복 후, 마우스의 복강 내(IP)로 0.1 mg/kg 농도의 부프레노르핀 130 µL를 주입하고, 영상 촬영 전 14일 동안 종양을 성장시킵니다. 마우스 영상 촬영 당일에는 시스템을 가동하여 레이저와 광검출기가 약 20분 동안 예열되도록 합니다.

드리프트와 시스템 민감도를 방지하기 위해, 100도 x 4도 설계 라인 디퓨저를 이미징 갠트리의 정중앙에 배치하여 여기 레이저가 시스템의 검출 채널들에 동일한 강도로 분산되도록 합니다. 모든 5개 광수집 채널에서 검출되는 신호량을 최대화하도록 디퓨저의 각도를 수동으로 조정하십시오. 그다음 광학 밀도 필터를 배치합니다.

모든 형광 검출 광전증배관(PMT)과 광학 밀도 측정 전단에 두 개의 중성 농도 필터를 배치합니다. 모든 투과율 검출 전단에는 하나의 중성 농도 필터를 배치합니다. PMT는 각 레이저에 대해 1초의 적분 시간을 갖는 100개의 시간적 펄스 확산 함수(T psf)를 순차적으로 수집합니다. 각 TPSF를 레이저 기준값으로 정규화하고 레이저 기준값의 시간적 드리프트를 보정한 후, 각 검출기와 각 레이저별로 모든 반복 횟수에 대해 평균을 냅니다.

이러한 평균 TPS는 영상 촬영 절차 12시간 전에 광학 이미지 재구성 과정에서 사용되는 검출기 특이적 기기 응답 함수입니다. 형광 추적자 칵테일을 실험용 마우스에 주입하십시오. 형광 단층 촬영 시스템의 정확한 보정과 동물의 움직임을 제한하는 것이 이 절차에서 가장 어려운 부분입니다.

영상 재구성은 매우 부정형(ill-posed)이기 때문에 데이터 수집 과정에서의 작은 오류만으로도 재구성된 영상에 상당한 오류가 발생할 수 있습니다. 정확한 데이터 수집을 보장하기 위해, 마우스를 가능한 한 최대한 고정하고 스캔 전후로 캘리브레이션을 반복하여 정확한 캘리브레이션 값을 얻을 가능성을 높입니다. 준비가 되면, 마취된 동물을 이미징 베드의 유리섬유 지지대 위에 놓습니다.

지속적인 가스 마취를 위해 코 콘(nose cone)에 머리를 위치시킨 후, 바이트 바(bite bar)로 치아를 고정하고 동물을 테이프로 고정합니다. 마우스는 영상 갠트리(imaging gantry)의 대략적인 중앙에 배치해야 합니다. 이러한 위치 설정은 여기 레이저를 마우스 주변으로 180도 회전시켜, 모든 각도에서 레이저의 초점이 마우스의 중앙 지점을 비추는지 확인하여 안내될 수 있습니다.

적절하게 위치시킨 후, 이미징 베드와 마우스를 micro CT 스캐너로 조심스럽게 옮기고 마우스 머리 전체에 대해 93 micrometers 등방성 해상도로 해부학적 정보를 수집합니다. CT 이미지 스택을 시각화하고 형광 토모그래피 시스템으로 촬영할 슬라이스를 선택합니다. 이미징 베드와 마우스를 형광 토모그래피 시스템으로 다시 조심스럽게 옮깁니다.

각 이미징 슬라이스에 대한 광원 위치 수, 각 TPSF 측정의 적분 시간, 각 광원 위치당 반복 횟수, 그리고 앞서 생성한 CT 이미지 스택에서 원하는 이미징 슬라이스의 위치와 수를 선택하십시오. 다음으로, 모든 여기광을 차단하기 위해 형광 검출 PMT 앞에 필터를 배치하고, 투과도 검출 PMT 앞에는 광밀도 중성 밀도 필터를 배치하십시오. 검출기의 포화를 방지하기 위해, 데이터 수집 소프트웨어를 실행하여 정의된 각 광원-검출기 위치에서 두 가지 여기 파장 모두에 대해 형광 및 투과도 t psf를 수집하십시오.

수집된 모든 T psf 세트에 대해, 기준 PMT 채널을 사용하여 레이저 강도를 모니터링하고 기록하십시오. 마우스의 외면과 이미징 베드의 위치를 결정하십시오. CT 이미지에서 지지대를 식별하고, 마우스와 이미징 로드의 범위를 덮는 마스크를 생성하십시오.

별도로, near fast 소프트웨어를 사용하여 마우스 마스크로부터 동물의 유한 요소 망(finite element mesh)을 생성합니다. micro CT 및 형광 공간 등록 좌표를 기반으로 형광 토모그래피 시스템의 광원 및 검출기 위치를 망 표면에 국소화합니다. 이미징 베드의 위치와 상호작용하는 광원 또는 검출기 위치와 관련된 광학 데이터 포인트는 제거합니다.

지지 로드(Support rods)는 각 광원 검출기 위치에서 수집된 데이터를 레이저 기준점으로 정규화하여 레이저 기준점의 시간적 드리프트를 보정하고, 구매 시 실험적 테스트를 통해 결정된 필터 감도를 보정합니다. 각 광원 검출기 위치 데이터의 본 비율(born ratio)을 구하고, 이를 균일한 광학 특성을 가진 유한 요소 동물 메쉬 기반의 투과율 순방향 모델 시뮬레이션 값과 곱합니다. 이는 광원 또는 검출기의 조직 결합과 관련된 오차를 완화하고, 데이터를 모델에 맞게 보정하며, 모델 데이터 불일치의 다른 측면들을 조정하기 위해 수행됩니다. 두 파장에서 수집된 본 비율 데이터의 스케일링된 차이로 구성된 데이터 벡터를 생성합니다.

EGFR 결합 대비를 최대화하도록 스케일링 인자를 선택하고, 각 검출 채널의 TPSF를 입력값으로 사용하여 교정된 차이 데이터로 시간 영역 영상 재구성을 수행하며, 이를 통해 관찰된 대비 증강 표적 추적자의 형광 맵을 생성합니다. 여기 U2 51 정위성 신경교종 종양이 있는 마우스의 코어지스트레이션된 CT 해부학적 영상 위에 형광 재구성 영상을 중첩한 예시가 있습니다. 형광 재구성으로 결정된 신경교종의 질량 중심은 대비 증강 자기공명영상으로 결정된 종양 질량 중심의 1mm 이내에 있었습니다.

데이터 수집을 위한 소프트웨어는 이 장치를 위해 맞춤 제작되었으나, 대부분의 이미지 처리 기술은 nearfasts.org에서 제공하는 near fasts 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있습니다. 따라서 이 절차를 시도할 때는 이미지 재구성 전에 시스템과 데이터가 모두 정확하게 보정되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 이러한 보정 과정에서는 바이오마커 표적 추적자의 이미지 재구성 이후, 검출기 간의 감도 및 시간적 차이를 반드시 고려해야 합니다.

표적화되지 않은 추적자를 이용한 유사한 영상 촬영은 수용체 비매개성 섭취를 보정하는 수단을 제공합니다. 이를 통해 추적자의 결합량과 생체 내 수용체 밀도를 개발 후 정량화할 수 있습니다. 이 기술은 다른 연구자들이 X선 영상 유도 형광 단층 촬영 시스템을 설계하도록 영감을 주었으며, 더 큰 동물의 전신 영상 촬영을 위한 길을 열었습니다.

이 영상을 시청한 후, 암 바이오마커 이미징을 위해 X선 해부학적 이미징과 광학 이미징 시스템을 결합한 확산 형광 토모그래피 실험을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.