에서 복제와 베타 세포 기능을 평가 Adenovirally-transduced 절연 쥐 Islets

본 절차의 전반적인 목적은 기능적 베타 세포 질량의 변화를 조절하는 신호 전달 경로를 식별하는 것입니다. 이는 아데노바이러스 벡터를 사용하여 유전자를 과발현시키거나 발현을 억제함으로써 분리된 쥐의 췌도에서 수행됩니다. 이러한 조작 후, 인슐린 분비를 통해 베타 세포 기능을 평가하고, 삼중수소화 티미딘 통합 측정을 통해 췌도 복제를 측정합니다.

궁극적으로, 이러한 분석법들은 관심 유전자가 인비트로(in vitro)에서 베타 세포의 증식 또는 기능을 조절하는지 여부를 보여줄 수 있습니다. 이 방법은 신호 전달 경로의 특정 성분이 베타 세포의 성장과 기능에 영향을 미치는지와 같이 눈꺼풀 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 필요한 수의 웰에 2 mL의 변형 배지를 첨가하여 조직 배양 코팅이 되지 않은 6-웰 플레이트를 준비하십시오.

예를 들어, 일반적인 실험에서는 바이러스 미처리 대조군, 바이러스 대조군, 실험군을 위해 각각 하나의 웰을 포함하여 총 3개의 웰이 필요할 수 있습니다. 조직 배양 인큐베이터에서 플레이트를 37 °C로 최소 30분 동안 가온합니다. 쥐의 안구(eyelet)를 분리한 즉시, 준비된 플레이트의 각 웰에 1~200개의 안구를 넣습니다. 60개의 안구는 생화학적 분석에 사용하고, 나머지 안구는 유전자 발현 연구 또는 면역 블롯팅(immuno blotting)에 사용할 수 있습니다. 플레이트를 가볍게 흔들어 안구가 각 웰의 중심에 오도록 합니다.

그런 다음 아데노바이러스를 디쉬 중앙의 안구 부위에 즉시 직접 피펫팅하십시오. 관심 단백질의 과발현 또는 넉다운에 대한 아데노바이러스의 효능에 따라 1에서 500까지의 감염다중도(multiplicities of infection)를 사용하십시오.

눈꺼풀 중심부까지 아데노바이러스를 효율적으로 침투시키면 결과의 일관성을 높일 수 있습니다. 눈꺼풀 분리 직후에 눈꺼풀에 형질전환을 수행하는 것이 필수적입니다.

플레이트를 5분 동안 그대로 둔 후, 인큐베이터로 옮겨 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 인큐베이터에서 플레이트를 꺼내어 아이렛(eyelet)을 웰의 중앙으로 부드럽게 확장시킵니다. 200 µL 마이크로 파이펫을 사용하여 아이렛을 신선한 배지가 담긴 새 웰로 옮깁니다.

아이렛이 플레이트에 달라붙은 경우, 파이펫 팁을 사용하여 조심스럽게 떼어낼 수 있습니다. 공초점 현미경을 이용해 아데노바이러스가 섬 핵심 배양물로 침투했는지 시각화함으로써, GFP를 발현하는 대조군 바이러스를 사용하여 적절한 형질 도입 효율을 확인하는 것이 도움이 됩니다. 배지를 매일 교체하며 1~3일 더 섬을 배양합니다.

배양 시간은 예비 연구를 통해 최적화해야 하며, 실험 목적에 따라 달라집니다. 마지막 24시간 동안, 배지 1밀리리터당 1\u00B5Ci 농도로 tritium-labeled thymidine을 배지에 첨가하십시오. 먼저 50mL 원뿔형 튜브에 SAB 작업액 50mL를 신선하게 조제하여 37°C 항온수조에서 가온하십시오.

15 mL 원뿔형 튜브에 작동용 SAB 10 mL를 피펫으로 넣고 2.5 M D-glucose 66.8 µL를 첨가합니다. 고농도 glucose SAB를 준비하려면, 남은 작동용 SAB 40 mL에 2.5 M D-glucose 44.8 µL를 첨가합니다. 다음으로 저농도 glucose SAB를 준비하기 위해 1.7 mL 마이크로 원심분리 튜브 세 개에 라벨을 부착합니다.

6웰 플레이트의 각 웰에 PBS 1mL를 추가합니다. 방사성 표지된 안구(eyelets)의 취급 및 폐기에 관한 기관 프로토콜을 반드시 준수하십시오. 실체현미경 또는 표준 현미경을 사용하여 크기가 비슷한 안구 20개를 선택해 각 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

예를 들어, 각 튜브에는 소형 아일렛 5개, 중형 10개, 대형 5개가 포함될 수 있습니다. 실험 종료 후 결과값을 총 단백질 함량으로 표준화하지만, 그룹 간 아일렛의 크기를 맞추는 것이 매우 중요합니다. 중력 또는 원심분리를 통해 아일렛이 튜브 바닥에 가라앉도록 한 후, 마이크로 피펫으로 PBS를 흡입하여 무게를 측정하고, 이어서 생화학 분석을 위한 아일렛 준비 과정을 진행합니다.

인슐린 분비 분석을 위해 아일렛(eyelets)을 준비하려면, 먼저 저농도 포도당 SAB로 사전 배양해야 합니다. 이를 위해 튜브에 저농도 포도당 SAB 400 microliters를 넣고 캡을 닫은 채 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다. 60분 후, 사전 배양에 사용한 저농도 포도당 SAB를 흡입하여 제거합니다. 기저 인슐린 분비를 측정하려면 사전 배양 과정을 반복합니다.

하지만 자극된 인슐린 분비를 측정하려면 저농도 포도당 SAB 대신 400 µL의 고농도 포도당 SAB를 사용하십시오. 이전과 마찬가지로 고농도 또는 저농도 포도당 SAB에서 배양한 후 60분 동안 eyelets를 배양하고, 제조사의 프로토콜에 따라 수행할 인슐린 방사면역측정법(radio immunoassay)을 위해 SAB를 흡입하여 제거하십시오. 그다음 동일한 eyelets 집단을 사용하여 티미딘 통합 분석(thymidine incorporation assay)을 진행하십시오. 인슐린 분비 분석에 바로 사용한 eyelets부터 시작하십시오.

PBS 1 mL를 첨가하고 안구 주변부(eyelets)가 중력에 의해 가라앉도록 둡니다. 그 다음 마이크로 파이펫으로 PBS를 흡입하여 제거합니다. 이 단계를 한 번 더 반복합니다.

다음으로, 안구 조직에 500 µL의 얼음처럼 차가운 trichloroacetic acid를 첨가하고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 4 °C에서 튜브를 원심 분리합니다. 그 후 흡입하여 TCA를 제거합니다.

다음으로, 0.3 normal 수산화나트륨 80 µL를 첨가하고 안구편(eyelets)을 상온에서 30분 동안 배양합니다. 배양하는 동안 10분마다 5~10초간 샘플을 강하게 볼텍싱(vortex)합니다. 이와 동시에, 7 mL 액체 섬광 계수관에 ConoSafe counting cocktail 4 mL를 첨가합니다.

아이렛(eyelets)의 배양이 완료되면, 50 µL의 아이렛을 신틸레이션 튜브에 넣습니다. 뚜껑을 닫은 튜브를 가볍게 흔든 후, 액체 신틸레이션 카운터로 시료의 방사능을 측정합니다. 또한, 단백질 농도를 측정하기 위해 10 µL의 vial을 상용 bionic acid assay에 옮기고 제조사의 프로토콜을 따릅니다.

이후 데이터 분석 단계에서, 설명된 프로토콜을 사용하여 단백질 농도에 따라 결과를 정규화하십시오. 아일렛 복제 및 베타 세포 기능. 쥐 아일렛에서 가설 유전자 6의 아데노바이러스 과발현을 평가한 결과, 베타 세포 기능의 변화 없이 아일렛 복제가 강력하게 촉진되었습니다.

쥐 소섬(eyelet) 내의 대부분의 세포가 베타 세포이기 때문에, gene six의 발현 증가와 함께 티미딘(thymidine) 통합으로 측정된 DNA 합성의 증가가 관찰되었습니다. 추가 실험을 통해 이러한 티미딘 통합의 증가가 베타 세포 복제의 증가로 인한 것임을 증명할 수 있을 것입니다. 인슐린 분비 분석 결과, gene six의 과발현이 저혈당 및 고혈당 상태에서의 인슐린 분비라는 베타 세포의 주요 기능 중 하나를 변화시키지 않았음을 확인하였습니다.

낮은 포도당 농도와 높은 포도당 농도에서의 인슐린 분비 증가는 아데노바이러스 처리 후 췌도(islet)의 건강 상태를 반영합니다. 만약 gene six의 발현 증가가 베타 세포 기능을 손상시킨다면, 이는 높은 자극 포도당 농도에서 분비되는 인슐린의 감소로 나타날 가능성이 높습니다. 이 영상을 시청한 후에는 특정 유전자가 베타 세포의 성장이나 기능에 영향을 미치는지 판단하기 위해 베타 세포 복제와 인슐린 분비를 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.