CD4의 분리 + Miltenyi 맥을 정제를 사용하여 마우스 림프절에서 T 세포

이것은 Max MIDI 자석입니다. 매우 강한 자기장이 발생하므로 주의하라는 문구가 적혀 있습니다. 안녕하세요, 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스 생리학 및 생물물리학과 Mike Collins 실험실의 Melanie Matthew입니다.

오늘은 Milton biotechnology 키트를 사용하여 CD4 양성 T 세포의 음성 선택 준비 과정을 보여드리겠습니다. 여기에는 minimax와 minimax magnets가 있는데, minimax는 대용량 분리에 사용됩니다. minimax에 맞는 컬럼을 통해 최대 10⁹개의 세포를 처리할 수 있으며, minimax magnets는 훨씬 더 적은 양의 세포를 처리할 때 사용됩니다.

따라서 양성 분리 또는 음성 분리 여부에 따라 적절한 항체로 세포를 라벨링합니다. 항체에는 자석에 부착되는 자기 비드가 달려 있습니다. 음성 선택의 경우, 관심 세포는 컬럼을 통과하여 빠져나오며, 관심 세포가 포함된 용출액(eluate)을 수집할 수 있습니다.

오늘 밤 여러분께 보여드릴 기술들은 멸균 상태가 아니라는 점을 말씀드려야겠습니다. 따라서 이 세포들을 세포 배양에 사용하시려면, 반드시 조직 배양 후드 내에서 멸균된 기구들을 사용하여 모든 과정을 수행해야 합니다. 비록 제가 CD4 양성 T 세포의 준비 과정을 보여드리고 있지만, 이러한 기술들 중 상당수는 Miltenyi Biotec 키트를 사용하여 다른 세포 유형을 정제하는 데에도 적용 가능합니다.

마우스에서 림프절을 제거하였으며, 이 과정에 대한 자세한 방법은 JoVE 7권의 '이광자 이미징을 위한 림프절 준비(lymph node preparation for two photon imaging)'에서 보여드렸습니다. 이제 70 µm 셀 스트레이너(cell strainer) 내부에서 림프절을 분쇄하여 단일 세포 현탁액으로 만들겠습니다. 6 mL 주사기의 뒷부분을 사용하여 림프절을 단일 세포 현탁액으로 분쇄하겠습니다.

림프절은 필터 내부의 RPMI 배지에 들어 있으며, 적절한 단일 세포 현탁액을 만드는 것이 중요합니다. 필터를 사용하는 이유는 세포 덩어리가 생기지 않도록 하기 위함입니다. 분쇄 과정을 마친 후, 배지에서 필터를 꺼내 체를 통과한 모든 세포를 회수하여 단일 세포 현탁액으로 사용합니다.

조직을 갈 때, 가능한 한 모든 조직을 충분히 분쇄해야 합니다. 이 단일 세포 현탁액에서 CD4 양성 T 세포를 정제하게 됩니다. 이제 조직 분쇄가 완료되었으며, 림프절의 대부분이 거의 다 분쇄된 것을 확인하실 수 있습니다.

여기에 여전히 소량의 지방 조각들과 약간의 결합 조직이 섞인 림프절 껍질 같은 부분들이 6개의 림프절 모두에서 엉겨 붙어 있습니다. 이제 셀 스트레이너(cell strainer)를 제거합니다. 보시면 배지가 매우 탁한 것을 확인할 수 있습니다.

필터에 붙는 세포가 있을 수 있으므로, 필터로부터 최대한 많은 수의 세포를 얻기 위해 단일 세포 현탁액으로 가득 채웁니다. 배지 몇 mL로 세척한 다음, 모든 배지를 15 mL Falcon 튜브에 피펫으로 옮기고 원심 분리하여 추후 정제를 위해 세포를 펠렛화합니다. 여기 300 G에서 10분 동안 원심 분리하여 펠렛으로 만든 단일 세포 현탁액이 있습니다.

단일 세포 현탁액에 사멸 세포의 비율이 높을 것으로 예상된다면, Miltenyi Biotec의 사멸 세포 제거 키트를 사용하는 것이 좋습니다. 이제 펠렛을 형성했으므로, 배지를 따라내고 적혈구 용해를 진행하겠습니다. 그 다음 세포 수를 측정하고, 이 특정 세포들에 대해 CD4 양성 T 세포 음성 선택 키트를 사용하겠습니다. 이제 RBC 용해를 시작하겠습니다.

먼저 물을 추가하여 용액의 삼투압을 낮춘 다음, 10 X-D-B-P-S를 추가하여 다시 1 x 용액으로 맞춰줌으로써 림프구와 함께 펠렛화한 적혈구를 용해할 것입니다. 림프구는 적혈구보다 삼투압 변화에 더 강하지만, 여전히 신속하게 작업해야 하며 그렇지 않으면 우리가 원치 않는 림프구까지 용해될 수 있습니다. 신속한 작업을 위해, 시스템에 실제로 물을 추가하기 전에 용해에 필요한 부피를 미리 준비해 둡니다.

림프구의 용해는 방지하고 적혈구만 선택적으로 용해시키기 위해, 물을 넣은 후 몇 초 뒤에 10 X-D-B-P-S-A를 추가하려고 합니다. 따라서 물 900 µL(거의 1 mL)와 10 X-D-B-P-S 100 µL를 취합니다.

두 파이펫을 모두 준비합니다. 용해 단계에서 물을 넣고 몇 초간 기다린 후, 튜브를 가볍게 흔들어 섞고 10 X-D-B-P-S를 추가한 다음 튜브를 조금 더 흔들어 줍니다. 용해하려는 적혈구가 많을 경우, 파괴된 세포막들이 뭉쳐 커다란 무정형 덩어리가 형성되는 것을 볼 수 있습니다.

여기에 소량이 있으며, 세포막이 약간 파괴된 것을 확인할 수 있습니다. 따라서 세포 용해(lysis)를 마친 후, 피펫팅 과정에서 실수가 있었을 경우에 대비해 배지를 수 mL 추가하여 삼투압을 적절하게 조절하고 세포 용해가 더 이상 진행되지 않도록 합니다. 이제 림프구를 단일 세포 현탁액 상태로 준비하였습니다.

다시 한번, 적혈구 용해를 마쳤으므로 이제 세포를 원심 분리하여 펠릿으로 만들겠습니다. 이 작업을 수행하기 전에, CD4 양성 T 세포 음성 선택 키트에 추가해야 할 항체의 양을 결정하기 위해 혈구계수기로 세포 수를 측정하겠습니다. 이제 Max buffer에서 세포를 원심 분리했으며, RBC 용해 후 펠릿이 훨씬 더 하얗게 변한 것을 확인할 수 있습니다.

이제 CD4 양성 T 세포에 대한 음성 선택(negative selection)을 진행하겠습니다. 먼저 세포를 원심분리하는 데 사용한 모든 배지와 Max buffer를 따라내어 제거합니다. 그런 다음, CD4 양성 T 세포 음성 선택의 첫 번째 단계인 biotin 항체 칵테일로 라벨링을 수행하겠습니다.

그런 다음 냉장고에서 10분 동안 배양합니다. 이제 세포의 초기 배양이 완료되었습니다. 이제 항생제가 결합된 마이크로비드를 첨가하고 다시 냉장고에 15분 동안 보관하겠습니다.

이번 세포 분리를 위해 Miltenyi Biotec의 LS 컬럼을 사용하겠습니다. 먼저 컬럼을 자성 홀더에 장착하고, 3 mL의 MACS 버퍼를 흘려보내 컬럼을 준비하겠습니다. 컬럼을 열어 돌출부가 자석 안쪽을 향하도록 배치합니다. 이제 컬럼에 MACS 버퍼를 첨가하면, 버퍼가 LS 컬럼을 따라 내려가 바닥으로 떨어지기 시작하는 것을 볼 수 있습니다. 컬럼의 용액이 모두 빠져나가 마르는 것에 대해서는 걱정하지 않으셔도 됩니다.

액체의 표면 장력으로 인해 세포를 추가할 때까지 용액이 마르지 않고 유지됩니다. 세포를 추가하기 전에 max 버퍼가 컬럼을 통해 완전히 통과하도록 하는 것이 중요합니다. 자시 biotin 자성 비드, 세포 및 max 버퍼를 넣고 15분간 배양한 후, 버퍼를 따라내고 세포 수에 적합한 양의 버퍼로 다시 현탁하겠습니다.

따라서 이에 대해서는 Milli-tiny 프로토콜을 확인해야 합니다. 그런 다음 Max 버퍼로 방금 헹군 컬럼에 이를 적용하겠습니다. 이제 컬럼에 세포 현탁액을 추가하겠습니다.

또한, 이것은 음성 선택 컬럼이므로, 통과하여 흘러나온 세포들을 수집할 것이며, 이 경우 이들은 모두 CD4 양성 T 세포여야 합니다. 이제 12 mL의 MAC 버퍼로 컬럼을 세척할 것이며, 다시 한번 CD4 양성 T 세포만 포함되어 있어야 할 용출액을 수집하겠습니다. 이제 CD4 양성 T 세포를 원심 분리하여 가라앉히고, 이를 재부유시킨 다음, tau 이미징에 사용할 적절한 염색약으로 라벨링하겠습니다.

또한 정제한 세포의 소량을 취해 anti CD3 및 anti CD4로 라벨링한 후 FACS로 분석하여 CD4 양성 T 세포의 순수한 집단이 확보되었는지 확인할 것입니다. 여기 방금 원심 분리한 세포의 모습입니다. 이들은 순수한 CD3, CD4 양성 T 세포 집단이어야 합니다.

지금까지 CD4 양성 T 세포의 음성 선택 과정을 보여드렸습니다. Miltenyi Biotec 키트를 사용하여 이 세포들을 마우스에 입양 이식하고, 이를 저희의 T-cell receptor-engineered mouse 실험에 활용할 예정입니다. 여러분의 실험에서도 좋은 결과가 있기를 바랍니다.