절연 Biventricular의 NADH 형광 이미징은 토끼 하트 워킹

본 실험 과정의 전반적인 목표는 대사를 연구하는 것입니다. 작동 심장 표본의 NADH 이미징을 통해 이를 수행하며, 먼저 토끼의 심장을 적출합니다. 그 다음 단계로 심장의 4개 방 모두에 성공적으로 캐뉼라를 삽입하여 작동 심장 모델을 구축합니다.

마지막 단계는 이미징 장비를 설정하고 서로 다른 페이싱 속도에서 NADH 데이터를 수집하는 것입니다. 궁극적으로, 형광 NADH 이미징을 통해 심장의 대사 변화를 확인할 수 있습니다. 랑게르도르프 관류(Langendorff perfusion)와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 심장이 정상 방향으로 혈류가 흐르고 심장 스스로 관상동맥 관류를 위한 압력을 제공하는 생리학적 상태에서 작동한다는 점입니다.

이 방법은 전기생리학 및 치명적 부정맥의 기전에 관한 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이는 관상동맥 유량 대사와 전기적 활동 사이의 연결 고리를 연구하기 위한 생리학적 모델을 제공함으로써 이루어집니다. 혈관 및 심실 캐뉼라 삽입 단계는 학습하기 어렵기 때문에 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.

부적절한 기술은 심장에 손상을 줄 수 있으며 실험 전체를 위험하게 만들 수 있습니다. 실험을 시작하기 전, 작동 심장 시스템 챔버 내의 모든 튜브를 정제수로 헹구고, 펌프를 가동하여 시스템 내의 물을 제거하십시오. LOR 관류 펌프, 좌심실 관류 펌프 및 우심실 관류 펌프의 라인에 셀룰로오스 막 필터를 추가하십시오.

시스템에 perfuse eight을 추가한 후, 각 압력 센서에 대해 2점 보정을 수행하십시오. 워터 재킷 튜브와 열교환기를 가열하는 가열 순환 항온수조를 켭니다. 항온수조를 켭니다. 이는 PERFUSE eight을 가열하는 데 사용됩니다.

PERFUSE eight를 폐회로로 순환시키는 펌프를 켜고, 순환 탱크를 작동시켜 Perfuse Eight에 산소를 공급하십시오. 마이크로파이버 산소 공급기 또는 혈액 필터가 80 kilopascals의 압력으로 perfuse eight에 95% 산소를 공급하고 있는지 확인하십시오. 마지막으로, 열교환기가 순환하는 perfuse의 온도를 일정하게 유지하고 있는지 확인하십시오.

토끼를 진정시킨 후, 우선 작업 심장 시스템을 정압 LRF 모드로 설정하여 37 °C에서 심장 적출을 시작하십시오. 대동맥 차단 압력을 50에서 60 사이로 설정하십시오.

펜토바르비탈(pentobarbital)과 헤파린(heparin)을 귀 가장자리 정맥 또는 뒷다리 안쪽의 외측 복재정맥에 주사합니다. 토끼의 통증 반사가 사라지면 신속하게 흉강을 엽니다. 심낭을 절개하고 대동맥을 클램프로 고정한 후 심장과 폐를 적출합니다.

폐정맥 분리를 용이하게 하기 위해 폐를 부착된 상태로 유지합니다. 다음으로, 주사기에 PF 8 60 milliliters와 heparin 200 units를 채웁니다. 5 millimeter 캐뉼라를 연결하고 대동맥에 캐뉼라를 삽입합니다.

0번 실크 봉합사를 사용하여 대동맥을 캐뉼라에 고정합니다. 그런 다음 주사기를 천천히 눌러 심장을 통해 혈액을 씻어냅니다. 먼저 심장을 대동맥 블록에 연결하여 작동 심장 시스템을 구축합니다.

커넥터에 비스듬한 각도로 접근하여, 커넥터가 연결된 상태에서 Perfuse eight이 캐뉼라로 천천히 떨어지게 합니다. 이렇게 하면 대동맥으로 공기가 유입되는 것을 막아, 정압 모드(constant pressure mode)로 심장에 관류를 수행하는 동안 관상동맥 색전증이 발생하는 것을 방지할 수 있습니다.

지방과 결합 조직을 제거하고 다음 혈관들의 위치를 확인합니다. 하대정맥과 상대정맥, 대동맥, 폐동맥 및 폐정맥입니다. 다음으로, 상대정맥을 결찰합니다.

우측 및 좌측 폐동맥으로 분지되는 지점 바로 아래에서 폐동맥을 절단하십시오. 남은 혈관들은 폐정맥입니다. 심장과 폐 사이에 있는 폐정맥들을 한데 모아 하나의 봉합사로 모두 결찰하십시오.

이는 두 가지 이유로 매우 중요합니다. 첫째, 폐와 연결된 혈관을 묶어주어야 캐뉼라 삽입이 완료된 후 누출이 발생하지 않음을 보장할 수 있습니다. 둘째, 이후의 캐뉼라 삽입을 위해 양측 VNA 대정맥을 격리하는 것이 중요합니다.

이제 폐를 제거합니다. 좌심방이의 모서리에 적절한 크기의 구멍을 내고, 그 안이 perfuse eight으로 충분히 채워졌는지 확인하십시오. 다음으로, 캐뉼라 내부가 perfuse eight으로 완전히 채워진 상태에서 심방이에 캐뉼라를 삽입합니다.

그런 다음 조직을 잡은 상태에서 캐뉼라를 부속기에 봉합합니다. 좌심방이의 조직은 매우 섬세하여 쉽게 찢어질 수 있습니다. 따라서 한 번의 시도로 좌심방에 캐뉼라를 삽입하는 것이 중요하며, 그렇지 않으면 삽입이 불가능할 수도 있습니다.

좌심방에 흐름을 제공하기 위해 2번 펌프를 켭니다. 실험 전반에 걸쳐 전부하를 2~6 tor 사이로 설정하십시오. 압력 조정이 필요할 수 있습니다.

목표 압력의 2mm 내로 유지하십시오. 이제 랭거 펌프인 1번 펌프를 잠시 꺼서 심장을 작동 심장 모드로 전환합니다. 대동맥압을 10 torr까지 낮춘 다음, 80에서 100 torr 범위 내로 천천히 올리십시오.

이를 통해 대동맥판막이 정상적인 생리적 조건에서와 같이 열리고 기능할 수 있게 됩니다. 시스템에 직접 연결된 캐뉼라를 사용하여 최종 후부하 압력을 최대 LV 압력보다 약 20 정도 낮은 값으로 설정하십시오.

하대정맥(inferior vena CVA)을 통해 우심방에 캐뉼라를 삽입하고, 캐뉼라를 정맥에 봉합합니다. 기포가 유입되지 않도록 주의하십시오. 우심방에 혈류를 공급하기 위해 3번 펌프인 우측 펌프를 작동시킵니다.

압력을 약 3 tor로 설정하십시오. 마지막으로, 공기가 유입되지 않도록 주의하며 우심실에 캐뉼라를 삽입하고, 캐뉼라를 폐동맥에 봉합하십시오. 이로써 양심실 캐뉼라 삽입이 완료됩니다.

이제 신호 획득 단계로 진행합니다. 대동맥 캐뉼라를 통해 압력 변환기 카테터를 대동맥으로 조심스럽게 삽입하십시오. 카테터를 대동맥판막 너머 좌심실(lv)까지 부드럽게 진입시킵니다.

카테터 팁이 적절한 위치에 놓이면 LV 압력 신호가 예상대로 나타납니다. 다음으로, 단상 활동전위 전극을 심실 심외막에 부드럽게 누르십시오. 전극 신호에 약간의 움직임 아티팩트가 발생하는 것은 정상입니다.

다음으로 실험 설계 위치에 따라 심장을 페이싱할 수 있도록 우심방에 양극 자극 전극을 배치합니다. 그리고 CCD 카메라의 초점을 심장의 관심 영역에 맞춥니다. 카메라에는 방출 필터가 장착되어 있어야 합니다.

NADH 형광을 측정하기 위해, 카메라가 부착된 워크스테이션에서 UV 광원으로 심외막을 균일하게 조사하고 주변 조명을 끕니다. 소프트웨어 설정을 통해 초당 2프레임의 속도로 이미지를 획득하도록 설정합니다. 그런 다음 라이브 업데이트 모드를 선택하여 관심 영역 내의 평균 픽셀 강도를 모니터링합니다.

관류가 적절했다면, 형광으로 나타나는 NADH 수준은 심외막 표면 전체에서 낮고 안정적으로 유지되어야 합니다. 이제 실험이 완료되면 실행을 종료하십시오. 심장을 제거합니다.

PERFUSE eight와 시스템 튜빙 및 챔버를 정제수로 배수합니다. 명시된 프로토콜에 따라 점막 TM 용액 또는 희석된 과산화수소 용액으로 시스템을 주기적으로 세척합니다. 심장은 분당 200에서 400회 사이의 주기 길이로 페이싱되었습니다.

이완기 LVP는 보통 0에서 10 Torr 사이였으며, 최소 이완기 대동맥압은 약 60 Torr였습니다. 최대 수축기 LVP는 충만압과 수축력에 따라 달라지며, 최적의 값은 60에서 80 Torr 사이여야 합니다. 최대 대동맥압과 최대 LVP는 서로 밀접하게 일치해야 합니다. 토끼 심장의 전형적인 단상성 활동전위는 빠른 탈분극상과 특징적인 재분극상을 가집니다. 준비물로부터 활동전위를 쉽게 기록할 수 있었으나, 대개 이완기 동안 작은 움직임 아티팩트가 발생했습니다.

심박수가 동성 리듬에 가까울 때, 300, 200 및 150밀리초의 주기 길이로 3회의 페이싱 사이클 동안 미토콘드리아 산화환원 상태의 변화를 모니터링하기 위해 빨간색 상자로 표시된 관심 영역의 평균 형광 NADH 값을 측정하였습니다. 주기 길이가 짧아져도 기저 NADH 수준은 비교적 일정하게 유지되었습니다. 300밀리초 미만에서는 기저 NADH 수준이 증가하였으며 150밀리초에서 가장 큰 증가를 보였고, 신호는 수축과 함께 진동하며 진동 빈도는 심박수와 일치합니다.

이러한 진동의 진폭은 항상 허혈 또는 저산소증으로 인해 발생하는 더 긴 시간 척도의 경향보다 작았습니다. 분당 200회 박동 시 전체 전면의 고해상도 형광 NADH 이미징은 분당 400회 박동 시 일정하고 공간적으로 균일했습니다. NADH 수치는 심외막 전체에서 상당히 증가했습니다.

상당한 공간적 불균질성이 관찰되었으며, 가장 큰 증가는 RV와 LV의 중격 영역 내에서 발생했습니다. 숙달되면, 이 기술은 정확하게 수행될 경우 45분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 대동맥이나 좌심방으로 기포가 유입되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에.

전압 민감성 염료를 심장에 로딩하는 것과 같은 추가적인 방법들을 통해, 국소 허혈과 같은 병리적 상황 발생 시 심장 표면의 전기적 활동과 대사 활동의 연관성을 확인하는 등의 추가적인 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술은 심장 생리학 연구자들이 보다 생리학적으로 유의미한 모델을 사용하여 병리적 조건에서의 심장 대사 및 전도 장애를 연구할 수 있는 길을 열어주었습니다.