가변 각도 총 내부 반사 형광 현미경 (VA-TIRFM)시 세포 접착의 Nanotopology

이 실험 절차의 전반적인 목표는 나노미터 정밀도로 기판 위 세포 접착의 토폴로지를 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 투명 유리 슬라이드에서 세포를 배양하고 형광 마커와 함께 인큐베이션합니다. 그런 다음 현미경 조절 거울의 각도 위치를 보정하고 해당 위치를 거울 위치 설정 프로그램에 저장합니다.

다음 단계는 약 10가지의 서로 다른 각도에서 조사 시 형광 이미지를 기록하는 것입니다. 마지막 단계는 수 나노미터의 정밀도로 세포-기질 간 거리를 계산하는 것입니다. 궁극적으로, 기질 위 세포 부착의 토폴로지 결과는 예를 들어 암세포와 덜 악성인 세포와 같이 다양한 세포주 간의 부착 차이를 보여주는 데 사용됩니다.

공초점 현미경과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 실제 해상도가 단 몇 나노미터 범위라는 점입니다. 이 방법은 세포막에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 작은 소포나 나노 물질과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.

실험 시연은 세포 샘플을 준비할 박사후 연구원 Petra와 실험을 진행할 엔지니어 Michael Wagner가 맡을 예정입니다. 가변각 전반사 형광 현미경 관찰을 위한 세포 준비를 위해, 10% fetal calf serum 및 항생제가 첨가된 배양액이 담긴 유리 슬라이드 위에 개별 세포를 100 cells/mm² 밀도로 분주합니다. 세포를 37 °C, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 72시간 동안 배양합니다.

다음으로, 배양 배지 내 8 µM 농도의 형광 막 마커 6-Dapio 2, dimethyl amino naphthalene 또는 lorane을 세포에 처리하고 형광 현미경 관찰 전 60분 동안 배양합니다. PBS로 세포를 세척하고, 버퍼 용액을 목적 슬라이드 위에 피펫팅하여 배지를 제거한 후, 목적 슬라이드 뒷면의 버퍼 용액을 닦아냅니다. 가변 각도 관찰을 위해 배면 조명 및 Axion E-M-C-C-D 카메라가 장착된 Zeiss Axio plan과 같은 정립 현미경을 사용합니다.

T-I-R-F-M은 컨덴서를 물체 슬라이드에 광학적으로 결합된 반원통형 유리 프리즘이 포함된 맞춤형 조명 장치로 교체합니다. 레이저 빔은 콜리메이티드 단일 모드 파이버로부터 입사되며, 유리 프리즘과 추가 광학 부품을 통해 결상된 후 샘플 표면에서 다시 평행 빔이 됩니다. 전기장 벡터가 입사면과 수직이 되도록 편광되었는지 확인하십시오.

이 위치는 파이버의 출력 커플러에 표시되어 있습니다. 콘덴서 내부에 위치하며 시료 평면에 결상되어 다양한 입사각 또는 물체 광선으로 시료를 조사하는 가변 거울을 사용하십시오. 가변 거울은 소프트웨어로 제어되는 스테핑 모터에 의해 구동될 수 있습니다.

각 위치는 go metric 측정으로 결정된 명확한 입사각에 대응합니다. 조절 가능한 거울의 각도 위치를 보정하려면, 물에 용해된 1 mM flavin nucleotide와 같은 형광 염료를 사용하십시오. 입사각 변화에 따른 임계각을 시각화하기 위해 glass-water 계면의 임계각인 61.3°를 고정값으로 사용하며, 입사각이 임계각과 일치하는 거울의 각도 위치는 거울 위치 제어 프로그램에 저장됩니다.

카메라 소프트웨어를 사용하여 온도 게인, 기록 시간, 시프트 속도를 포함한 E-M-C-C-D 카메라의 파라미터를 설정합니다. 샘플의 광학적 접촉을 보장하기 위해 침전유를 사용하십시오. 유리 프리즘을 사용하여 세포에 적합한 배율과 적절한 개구수(numeric aperture)를 가진 대물렌즈를 선택합니다.

현미경으로 시료를 관찰하려면 형광 검출에 적합한 롱패스(long pass) 또는 밴드패스(band pass) 필터를 사용하십시오. 조명 각도를 변경하며 동일한 시료의 형광 이미지를 기록하십시오. 입사각은 임계각과 같거나 그보다 커야 합니다.

셀-유리 계면의 임계각이 64.5도인 경우, 0.5도 또는 1도 간격으로 66도에서 74도 사이의 각도 범위를 권장합니다. 데이터 분석을 시작하려면 LabVIEW 프로그램을 사용하여 다양한 각도에서 기록된 이미지와 카메라 설정, 들뜸 파장 및 굴절률을 읽어옵니다. 유리의 굴절률인 1.52와 셀의 굴절률인 1.37 설정을 가져와 데이터를 적절하게 평가합니다.

각 매개변수 세트에 대해, 절차의 성공을 위해 침투 깊이와 투과 계수가 자동으로 계산됩니다. 이미지를 신중하게 기록하고 분석 대상으로 선택하는 것이 중요합니다. 식에 따라 세포-기질 간 거리 평가에 사용할 이미지를 선택하십시오.

막 마커의 경우, 이 예시와 같이 균일한 조명 하에서 촬영된 개별 이미지는 제외될 수 있습니다. 세포 기질 토폴로지 이미지를 계산하고, 평가 중에 표시할 적절한 색상 코드를 선택하십시오. 개별 픽셀의 프로파일은 이 그림에 표시된 것과 같이 나타낼 수 있습니다.

이 프로파일들은 적합도의 품질을 나타내는 지표로 사용될 수 있습니다. 마지막으로, 평가 프로토콜을 저장하십시오. 이 그림은 TP 53 종양 억제 유전자가 활성화된 U2 51 mg 교모세포종 세포의 전반사 이미지를 보여줍니다.

다양한 입사각에서 기록한 분석 결과, 66도는 소멸 전자기장의 침투 깊이가 약 140 nanometers에 해당하며, 69도는 침투 깊이 75 nanometers, 73도는 침투 깊이 60 nanometers에 해당하여 침투 깊이가 점차 감소합니다. 침투 깊이가 얕아질수록 형광 강도가 감소하며, 이는 세포 가장자리의 초점 접착(focal contacts)과 같이 세포의 더 표면적인 부위에서 기인합니다. 세포와 기판 사이의 거리는 여기에서 보는 바와 같이 0에서 600 nanometers까지의 색상 코드로 패널 D에 표시되어 있습니다.

세포-기질 간 거리는 흰색에서 노란색으로 표시된 단 몇 나노미터부터 진한 빨간색으로 표시된 250 to 300 나노미터까지 세포마다 매우 다양하게 나타납니다. 이는 초점 접촉 부위와 더 큰 세포-기질 간 거리가 서로 인접해 있음을 나타냅니다. 이와 유사한 세포-기질 간 거리의 변화가 종양 억제 유전자 P 10이 활성화된 U2 51 mg 교모세포종 세포에서도 계산되었습니다.

대조적으로, 노란색으로 표시된 U2 51 mg 대조군 세포와 주황색에서 빨간색으로 표시된 야생형 세포의 세포-기질 거리는 발달 이후 상당히 일정하게 유지됩니다. 이 기술은 세포-기질 위상 분야의 연구자들이 종양 세포와 레이저 치료에 따른 형태학적 변화를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 생물체에 무해한 낮은 광노출 상태에서 나노미터 범위의 실제 해상도로 표면을 시각화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.