유전자 표현 기계의 기능 Assays을위한 소규모 핵 추출물

다음 실험의 전반적인 목표는 세포에서 추출한 기능적 핵 기구를 사용하여 유전자 발현을 분석하는 것입니다. 이를 위해 먼저 HeLa 세포를 수확하여 팽창시킵니다. 그다음 세포를 용해하여 분해하고, 세 번째 단계에서 원심분리를 통해 핵을 침전시킵니다.

수용성이고 기능적인 유전자 발현 기구를 얻기 위해 핵을 염분 추출, 농축 및 투석합니다. 최종적으로, RNA 중합효소 전사 및 스플라이싱 결합 시스템으로 평가한 전사와 스플라이싱 활성을 바탕으로 핵 추출물의 기능성을 평가할 수 있습니다. 대량 핵 추출물 준비와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 적은 양의 세포로도 핵 추출물을 준비할 수 있다는 점입니다.

FBS와 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 HeLa 세포를 150 mm 플레이트 3개에 분주하는 것으로 시작합니다. 세포가 90% 합류도(confluency)에 도달할 때까지 37 °C, 5% CO2 인큐베이터에서 배양합니다. 이 시점에서 HeLa 세포 배양물에서 배지를 흡입하여 제거하고, 플레이트당 13 mL의 상온 PBS로 한 번 세척한 다음 PBS를 흡입하여 제거합니다. 각 플레이트를 몇 초 동안 옆으로 세운 뒤 남은 PBS를 모두 흡입하여 제거합니다.

다음으로, 셀 리프터를 사용하여 각 플레이트의 하단 가장자리로 세포를 긁어모은 후, 1.5 milliliter einor 튜브로 세포를 끌어당깁니다. 마지막으로, 마이크로 원심분리기를 사용하여 100×g, 4 °C에서 5분 동안 세포를 펠렛화합니다. 이제 세포 펠렛에서 PBS를 흡입하여 제거하고, 튜브의 눈금을 확인하여 적혈구 용적 또는 PCV를 추정합니다.

그 다음 PCV 부피의 2배에 해당하는 저장성 완충액을 세포 펠릿에 추가합니다. 튜브를 부드럽게 흔들어 재현탁합니다. 필요에 따라 1000 µL 피펫으로 세포 현탁액을 부드럽게 파이펫팅하여 세포 응집물을 풀어줍니다.

그 다음 이전과 동일한 원심분리 조건으로 세포를 펠릿화합니다. 원심분리가 끝나면 저장 버퍼 층을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 이때 세포가 팽창하기 시작하여 세포 부피가 약 750 to 1000 microliters까지 증가하게 됩니다.

최종 부피가 1.5 milliliters가 되도록 새로운 저장성 버퍼를 추가하고, 버퍼 내에서 세포를 다시 현탁합니다. 마지막으로, 현탁된 팽윤 세포를 얼음 위에서 10분 동안 냉각하며 배양합니다. 균질기를 저장성 버퍼로 헹군 다음 세포와 함께 얼음 위에 둡니다.

그런 다음 Kimwipe와 같이 섬세한 작업용 와이퍼를 사용하여 유발을 건조합니다. 1000 µL 연장 마이크로 피펫 팁을 사용하여 다운스(downs)에서 버퍼를 제거합니다. 이제 피펫을 사용하여 냉각된 팽윤 세포를 다운스 다운(downs Down)으로 옮깁니다.

본 절차에서 성공을 위해 가장 까다로운 부분은 세포 용해 여부를 확인하는 것입니다. 각 단계 후 현미경으로 확인하며, 기포가 생기지 않도록 주의하면서 용해용 페스틀을 천천히 위아래로 5회 움직여 세포를 용해시킵니다. 다음으로, 용해된 세포 현탁액 5 µL를 에펜도르프 튜브에 옮기고 trypan blue 10 µL와 1X PBS 15 µL를 추가합니다.

슬라이드에 세포 용액을 첨가하고 광학 현미경으로 세포의 용해 여부를 관찰합니다. 용해된 세포의 핵은 3시간 후에 파란색으로 나타납니다. 다수의 살아있는 세포가 관찰되므로 용해가 충분하지 않은 상태입니다. 5시간 후에는 충분히 용해되었습니다.

마지막으로 용해된 세포를 미리 냉각시킨 에펜도르프 튜브로 옮기고, 마이크로 원심분리기에서 1500 ×g, 4 °C로 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다. 그 다음, 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 이제 튜브의 눈금을 확인하여 핵 접합 부피(PNV)를 추정합니다.

마이크로 피펫 팁에 PNV의 절반 분량의 저염 버퍼를 채웁니다. 그다음 에핑도르프 튜브 바닥에 있는 핵 내부로 마이크로 피펫 팁을 삽입합니다. 부드럽게 섞으면서 버퍼를 핵 내부로 천천히 분사합니다.

튜브를 가볍게 튕겨 펠렛이 완전히 재현탁되었는지 확인합니다. 다음으로, PNV의 절반량에 해당하는 고염 농도 버퍼를 첨가하고 튜브를 한 번 빠르게 뒤집어 섞어줍니다. 4°C에서 30분 동안 튜브를 회전시킵니다.

마지막으로, 마이크로 원심분리기를 사용하여 핵을 18,000 ×g, 4°C에서 15분 동안 원심분리합니다. 상층액 500 µL를 냉각된 마이크로 콘(micro cons)으로 옮깁니다. 고염 핵 추출물을 14,000 ×g, 4°C에서 15분 동안 원심분리한 후, 미니 라콘(mini racon)을 뒤집어 새로운 개별 EOR 튜브에 넣습니다.

4°C에서 1000 ×g로 2분 동안 원심분리하면, 고농도 염 핵 추출물은 약 115 µL로 농축됩니다. 이제 고농도 염 핵 추출물을 45 µL씩 소분하여 미니 투석 SLI로 옮깁니다. 이때 슬라이드 바닥이 플로터 바닥과 닿아 있는지 확인하십시오.

그런 다음 SLI를 500 milliliters의 냉각된 투석 완충액에 넣습니다. 마지막으로, 분주액을 4 °C에서 1~2시간 동안 교반하며, 투석 후 핵 추출물은 혼탁하게 보일 것입니다. 이 그림은 소규모 핵 추출물과 대량 핵 추출물에서의 결합된 RNA polymerase II 전사 및 splicing 반응을 비교한 대표 데이터를 보여줍니다.

A-C-M-V-D-N-A 구조체를 대량 또는 소규모 추출물에서 배양했을 때, 전사를 차단하기 위해 alpha 및 manin을 첨가한 후 5분 시점에서 유사한 수준의 nascent pre mRNA가 합성되었습니다. splicing 중간체와 splice 생성물은 두 종류의 추출물 모두에서 유사한 역학으로 시간이 지남에 따라 축적되었습니다. 이러한 대표적인 결과는 결합된 RNA polymerase II 전사 및 splicing 시스템의 효율이 대량 및 소규모 핵 추출물에서 유사함을 확인시켜 줍니다. 소규모 추출물의 유용성을 입증하기 위해, splicing 억제제인 E 7 1 0 7 또는 음성 대조군 화합물인 Platy analy F로 처리한 HeLa 세포로부터 추출물을 준비한 후, 이 그림에서 보여준 것과 같이 결합된 RNA polymerase II 전사 및 splicing 분석을 수행했습니다. 그 결과, Platy F 및 E 7 1 0 7 처리 세포 모두에서 준비된 추출물에서 RNA polymerase II에 의한 전사가 효율적으로 일어났습니다.

반면, analy F 처리 세포로 준비한 추출물에서는 splicing이 정상적으로 일어났으나, E 7 1 0 7 처리 세포에서는 abolished되었습니다. 이러한 데이터는 소규모 세포 특수 처리에 소규모 핵 추출물을 사용하는 것에 대한 개념 증명을 제공합니다. 이 기술을 숙달하면 5시간 이내에 완료할 수 있습니다.