나노 크기의 지질 Vesicles의 준비를 위해 지속적인 압력 제어 압출 방법

다음 실험의 전반적인 목표는 생물학적으로 유효한 지질 소포를 제조하는 견고한 방법을 제시하는 것입니다. 이는 인지질을 유리 바이알에 혼합 및 전이시킨 후, 수성 완충액으로 수화시켜 다중 층판 SLE 현탁액을 생성함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로 동결-해동법을 수행하며, 이를 통해 다중 층판 소포로부터 단일 층판 소포를 생성합니다.

다음으로, 결정된 최적 압력을 사용하여 리포좀 현탁액을 익스트루더(extruder)에 통과시켜 원하는 크기의 균일한 지질 소포를 생성합니다. 동적 광산란법(dynamic light scattering) 및 나노입자 추적 분석(nanparticle tracking analysis)을 통해 일관된 서브마이크론 크기의 소포가 형성되었음을 확인하는 결과를 얻었습니다. 초음파 처리나 침전법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 효율적인 지질 소포 크기 조절을 위해 최적화된 질소 유량이 적용된 압력 제어 시스템을 사용한다는 점입니다.

이 절차를 시작하려면 Teflon 라이닝 캡이 있는 20 milliliter 유리 바이알을 준비하고, 오염을 방지하기 위해 사용 전 모든 유리 기구와 주사기를 클로로포름으로 세척하십시오. 250 microliter 밀폐형 유리 주사기를 사용하여 시약 등급의 클로로포름 100 microliters를 유리 바이알로 옮깁니다. 100 microliter 밀폐형 유리 주사기를 사용하여 동일한 유리 바이알에 시약 등급의 메탄올 30 microliters를 추가하십시오.

10 mg/mL POPC 216 µL, 10 mg/mL POPE 42 µL, 그리고 11 mg/mL 콜레스테롤 용액 20 µL를 20 mL 유리 바이알에 옮겨 2 mM POPC/POPE/콜레스테롤 지질 용액을 준비합니다. 바이알 바닥에 지질의 얇은 막이 관찰될 때까지 아르곤 또는 질소 가스를 천천히 흘려 유기 용매를 증발시킵니다. 뚜껑을 열어둔 유리 바이알을 진공 데시케이터에 넣고 최소 30분 동안 보관합니다.

잔류 용매를 제거하기 위해, 이전에 0.2 micron 필터로 여과한 버퍼 2 mL를 유리 바이알에 옮겨 지질을 수화시킵니다. 혼합물을 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하며, 리포좀 크기가 30에서 100 nm인 경우 48시간 이내에 사용하십시오. 리포좀 현탁액을 액체 질소에 15초 동안 급속 냉동합니다.

그런 다음 42 °C의 가열 블록을 사용하여 리포좀 현탁액을 약 3분 동안 해동합니다. 동결-해동 과정을 총 5회 반복합니다. 동결 후 해동을 수행하면 다중층 소포(multi lamella vesicles)로부터 단층 소포가 형성되며, 압출 과정 중의 지질 포집 효율이 향상됩니다.

다음으로, Avastin 지침에 따라 lipo so fast LF 50 압출기를 조심스럽게 조립하여 압출을 준비하십시오. 질소 누출은 원하는 유속에 영향을 미치므로 올바른 조립이 매우 중요합니다. 성공적인 수행을 위해 다음 단계를 주의 깊게 진행하십시오.

기밀 밀봉을 위해, 대공 지지 스크린을 지지 필터 베이스에 넣은 후 원형 센터 디시, 드레인 디스크 1개, 폴리카보네이트 멤브레인 1개를 순서대로 배치합니다. 멤브레인 위에 작은 검은색 O-링을 올리고 이를 지지 필터 베이스에 고정합니다.

네 개의 해당 구멍에 네 개의 나사를 조여 상단 필터 압출기를 부착합니다. 대형 압출 배럴 아래에 필터 압출기 유닛을 조립합니다. 압출 배럴 상단의 실린더 배럴에 리포좀 용액을 넣습니다.

커다란 원형 O-링, 좁은 캡, 커다란 원형 O-링 및 원형 캡을 배치합니다. 가스 레귤레이터를 압출기 배럴 상단에 부착하고, 압력 방출 밸브를 포함한 모든 밸브를 닫아 공기 누출을 방지합니다. 압출기 필터 유닛 아래에 20 milliliter 유리 바이알 또는 50 milliliter 삼각 플라스크를 놓습니다.

안전 밸브가 레귤레이터에 연결되어 있으며, 압력이 600 PSI를 초과하면 압력을 방출합니다. 질소 가스를 켜고 압출기에 연결된 가스 밸브를 엽니다. 질소 압력을 400 nanometer 리포좀의 경우 25 PSI로, 100 nanometer 리포좀의 경우 125 PSI로, 30 nanometer 리포좀의 경우 400 ~ 500 PSI로 높입니다. 질소에 의해 밀려나 리포좀 현탁액이 용기로 배출될 때까지 관찰합니다.

액체가 더 이상 보이지 않을 때까지 질소 흐름을 유지하십시오. 압출 필터를 통해 유리 파일로 통과시켜 DLS 분석을 수행합니다. 먼저, 인산 완충 식염수 또는 PBS에 희석된 20 µM 리포좀 용액 50 µL를 준비하십시오.

그 다음 전원과 램프 광원을 켭니다. dynapro 소프트웨어를 실행하십시오. 원하는 크기의 리포좀을 검출할 수 있도록 소프트웨어를 알고리즘 모델로 설정합니다.

하드웨어에 연결한 후, 14 µL의 리포좀 샘플을 석영 큐벳에 피펫팅하여 셀 홀더에 삽입하고, 시작 버튼을 누릅니다. 약 20~30회 데이터 수집 후 정지 버튼을 누릅니다. 히스토그램에 기록된 평균 리포좀 직경 피크를 분석합니다. 나노입자 추적 분석은 PBS에 용해된 500 µL의 0.1 µM 리포좀 용액 준비로 시작하며, 샘플 챔버를 물과 에탄올로 헹굽니다.

그 다음 보풀 없는 종이 타월로 시료 챔버를 건조합니다. 레이저 전원과 컴퓨터를 켜고 300 µL의 0.1 M 리포좀 용액을 시료 챔버에 주입합니다. 온도 제어 장치와 나노입자 추적 분석 소프트웨어를 실행합니다.

캡처 버튼을 눌러 레이저를 켭니다. 수평 및 수직 조절 장치를 사용하여 스테이지를 이동시키고 현미경 초점을 조정합니다. 원하는 온도와 기록 시간을 설정하십시오.

기록 버튼을 눌러 지정된 시간 동안 리포좀 입자의 사진 프레임을 여러 번 촬영합니다. 각 입자의 움직임을 추적하여 히스토그램에 나타나는 리포좀 크기 직경에 해당하는 피크를 분석합니다. DLS는 산란광을 수집하여 입자 직경을 결정하는 확립된 방법이며, 리포좀 크기를 측정하기 위해 수행되었습니다.

수화된 리포좀을 서술된 프로토콜에 따라 다양한 크기와 압력의 폴리카보네이트 멤브레인으로 압출하였습니다. DLS로 측정한 리포좀의 직경은 30 nanometer 공극 크기의 경우 66 ± 28 nanometers였으며, 100 nanometer 공극 크기의 경우 138 ± 80 nanometers, 400 nanometer 공극 크기의 경우 360 ± 25 nanometers였습니다.

직경 50 nm로 연마된 Irene 비즈 현탁액을 보정 표준물질로 사용하였으며, 측정된 직경은 47 ± 16 nm였습니다. 다분산 지수(percent poly dispersity)를 통해 리포좀 크기 간의 중첩이 없음을 확인하였습니다. DLS 분석은 큰 입자에 편향되는 특성이 있으므로, 일반적으로 30 nm보다 큰 직경이 관찰됩니다.

이러한 기기적 한계에도 불구하고, 검정 곡선은 선형 상관관계를 나타냅니다. 나노입자 추적 분석(Nanoparticle tracking analysis)은 입자의 굴절률이나 밀도와 관계없이 액체 매질에서의 확산을 직접 관찰하여 각 입자의 크기를 측정하는 새로운 기술입니다. 이 고해상도 기술을 DLS를 이용한 리포좀 측정의 보완 방법으로 사용할 수 있으며, 검정에 사용된 100 nm 및 400 nm 폴리스티렌 용액 두 가지에 대해 NTA로 기록된 직경은 각각 95 ± 48 nm 및 356 ± 51 nm였습니다.

지질 용액은 DLS와 비교했을 때 더 유사한 직경을 나타냈으며, 평균 크기는 30 nm 공극 크기의 경우 29 ± 14 nm, 100 nm 공극 크기의 경우 95 ± 17 nm, 400 nm 공극 크기의 경우 359 ± 73 nm로 측정되었습니다. NTA는 50에서 1000 nm 크기의 입자를 측정할 수 있는 감도를 갖추고 있어, 미세 입자를 정량화하는 더 일반적인 특성 분석 기술이 될 수 있습니다. 검량선은 폴리카보네이트 막의 공극과 기록된 NTA 직경 사이에 선형 상관관계가 있음을 보여줍니다. 음성 염색 투과 전자 현미경 이미지에서는 압출 후 각 리포좀 크기가 30, 100, 400 nm로 서로 명확하게 구분됨을 확인할 수 있습니다.

배율은 25,000배로 설정하였으며, 스케일 바는 0.5 microns를 나타냅니다. 세 가지 리포좀 크기로 시간 경과 실험을 수행하였습니다. 압출 직후 각 리포좀 용액에 대해 DLS를 측정하였습니다.

모든 리포좀 용액은 4°C에서 하룻밤 동안 보관되었습니다. 하룻밤 배양 후 DLS를 통해 직경을 다시 측정하였습니다. 60시간의 배양 기간 후에는 변화가 거의 또는 전혀 관찰되지 않았습니다. 이 절차를 수행할 때, 압출 필터를 여러 번 통과시키면 베시코 용액의 균질성을 높일 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

또한, 클로로포름에 의한 폴리프로필렌 튜브의 용출로 인한 오염을 방지하기 위해 시료 준비 시 유리 바이알과 주사기를 사용하십시오.