종양 세포 침략에 중간 유체 흐름의 효과를 측정하는 세 가지 차원 세포 배양 모델

본 절차의 목적은 3D 배양된 세포를 간질액 흐름에 노출시키고, 흐름에 의해 매개되는 세포 침습 효과를 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 type one collagen과 matrigel로 구성된 겔 용액을 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 해당 겔 용액에 특정 농도의 세포를 첨가하는 것입니다.

다음으로, 세포 현탁액을 직경 12 millimeter, 공극 크기 8 micron의 트랜스웰(transwell)에 넣고 매트릭스가 겔화될 때까지 37 °C에서 배양합니다. 분석 설정의 마지막 단계는 정적 및 흐름 조건을 형성하기 위해 트랜스웰에 특정 양의 배지를 추가하는 것입니다. 24시간 후, 침습된 세포 수를 정량화하기 위해 트랜스웰 막을 고정하고 염색하여 시각화합니다.

미세유체, 간질 흐름 챔버와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 펌프나 특수 장비가 필요하지 않으며, 연구자가 여러 조건이나 처리 방법을 쉽고 빠르게 테스트할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 세포 이동 및 침습에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 단백질 발현, 세포 증식 및 세포 신호 전달의 변화와 같이 다른 관련 세포 행동에 간질액 흐름이 미치는 영향을 연구하는 데에도 사용하거나 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 LIMA two chaa가 될 것입니다.

본 실험실의 대학원생이 4°C 얼음 위에 Matrigel 소량을 분주하며 이 절차를 시작합니다. 다음으로 PBS 멸균수, 수산화나트륨, Matrigel, 그리고 rat tail type one collagen을 사용하여 겔 레시피를 준비합니다. 그런 다음 얼음 위에서 겔 성분들을 동일한 순서대로 혼합하고, 최종 용액을 4°C에서 1시간 동안 배양합니다.

이제 멸균된 핀셋을 사용하여 지름 12 mm의 8 $\mu$m 공극 세포 배양 인서트를 12웰 플레이트에 배치합니다. 그다음 세포 수를 측정하고 무혈청 배지에서 5 $\times$ 10⁶ cells/mL 농도로 재현탁한 후, 세포 현탁액 100 $\mu$L를 젤 용액 900 $\mu$L에 첨가합니다. 그 후, 피펫팅을 통해 부드럽게 위아래로 섞어 충분히 혼합합니다.

그 후, 최종 혼합물 150 µL를 각 인서트에 추가합니다. 그런 다음 인서트를 37 °C, 5% CO2 인큐베이터로 옮겨 겔이 중합될 때까지 30분 동안 배양합니다. 정적 조건의 경우, 겔 위에 무혈청 배지 100 µL를 추가하고 인서트 아래에 1,200 µL를 추가합니다.

웰 내 인서트 내부와 외부의 액체 수준은 거의 동일해야 하며, 이를 통해 겔 양단에 가해지는 압력 차이를 최소화하고 간질 유동이 없도록 해야 합니다. 유동 조건의 경우, 인서트 아래에 100 µL의 무혈청 배지를 추가하고 겔 위에는 650 µL를 추가하십시오. 이때 인서트 아래에 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 기포가 생기면 해당 위치에서 세포가 막을 통해 이동하는 것이 방해받을 수 있습니다.

그 다음 플레이트를 37 °C, 5% CO2 인큐베이터에 24시간 동안 배양합니다. 이 단계에서는 인서트를 세척하기 위해 새로운 24-well 플레이트의 각 웰에 1× PBS 500 µL를 추가합니다. 그런 다음 flow trends 웰의 상단부에 남아 있는 배지를 제거합니다.

다음으로, 면봉을 사용하여 인서트에서 겔을 제거합니다. 비-VA 세포를 제거하기 위해 멤브레인 표면의 윗부분을 닦아냅니다. 그런 다음, 1배 PBS가 들어 있는 24웰 플레이트에 인서트를 15초 동안 넣어 세척합니다.

그 후, PBS를 제거하고 각 인서트 아래에 4% para formaldehyde 500 microliters를 첨가합니다. 이행된 세포를 고정하기 위해 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 PFA를 제거하고 500 microliters의 PBS로 한 번 헹구어 잔류 고정액을 제거합니다.

다음으로, 인서트 아래에 0.5% Triton X 100 용액 500 µL를 넣고 상온에서 10분 동안 배양합니다. 세포를 투과화하기 위해 면도날을 사용하여 인서트에서 멤브레인을 잘라냅니다. 그런 다음, 1× PBS 용액에 2 µg/mL DPI가 포함된 100 µL 용액에 멤브레인을 넣습니다.

멤브레인의 아랫면이 아래를 향하도록 주의하여 배치하십시오. DPI 용액은 사용하기 몇 분 전에 준비하여 암소에 보관해야 합니다. 이제 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸십시오.

이를 진탕기(shaker)에 넣고 상온에서 150 RPM으로 30분 동안 반응시킵니다. 그 다음 500 µL의 PBS로 막(membrane)을 1회 세척한 후, 다시 진탕기에 넣고 10분 동안 반응시킵니다. 결합되지 않은 jy를 제거하기 위해 세척 과정을 2회 더 반복합니다.

다음 단계는 투과된 세포가 위를 향하도록 막을 유리 슬라이드 위에 놓는 것입니다. 막에 마운팅 용액을 첨가합니다. 그런 다음 커버슬립으로 덮습니다.

그 후, 핵의 dappy 염색을 계산하고 동봉된 원고에 따라 침습된 세포의 수를 산출합니다. 이 그림은 막 위로 이행된 MDA MB 4 35 s 세포를 보여줍니다. 침습된 세포는 간질액 흐름 침습 분석 후 고정되었으며, 침습된 세포의 계산을 용이하게 하기 위해 DPI 및 Alexa Fluor 4 88 접합 foid로 염색되었습니다.

명시야(brightfield) 하에서의 막의 모습이며, 여기에는 DAPI로 염색된 핵들이 보입니다. F-actin으로 염색된 Alexa Fluor 488-phalloidin이 여기에 나타나 있습니다. 이 그래프는 MDA-MB-435 전이성 흑색종 세포의 침윤이 간질액 흐름(interstitial flow)에 의해 유의하게 증가했음을 보여줍니다.

24시간 후, 결과는 정적 침습 조건의 평균값으로 정규화하며, 6개의 세포 배양 인서트의 평균값을 제시합니다. 조건 간의 차이는 P 값이 0.003으로 통계적으로 유의미합니다. 숙련되면 간질액 흐름 분석법은 2시간의 준비, 24시간의 배양, 그리고 트랜스웰 막의 고정 및 염색을 위한 2시간의 과정으로 수행할 수 있습니다.

이 절차를 통해 세포, 단백질 또는 핵산을 쉽게 추출할 수 있으며, 이를 통해 간질액 흐름에 반응하여 유전자 및 단백질 발현이 어떻게 변화하는지와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 개발 이후, 이 방법은 간질 흐름이 암세포에 미치는 영향을 연구하는 연구자들에게 필수적인 분석법이 되었습니다.