복합에 의한 마우스의 싱글 셀 해상도에서 폐 Metastases의 향상된 시각화

본 절차의 전반적인 목표는 팽창된 폐 구조를 유지하면서 마우스 폐의 ex vivo 미세 전이를 더 잘 검출하는 것입니다. 이를 위해 먼저 PBS를 이용해 in situ 폐 관류를 수행하여 해당 조직의 주요 색상 배경 원인인 혈액을 제거합니다. 다음 단계로 PFA를 주입하여 폐를 팽창시킨 후, 폐 조직이 팽창된 상태로 고정되도록 꼬집어 차단합니다.

다음으로, 폐를 적출하여 PFA로 추가 고정하거나, 동결 절편 제작을 위해 단일 폐엽을 포매합니다. 마지막 단계로, Xal 용액으로 조직을 염색하여 LA zag 종양 세포를 시각화합니다. 궁극적으로 전체 폐엽 또는 폐 조직 절편 내의 전이를 쌍안 현미경이나 광학 현미경을 통해 단일 세포 수준까지 검출할 수 있습니다. 기존의 sky standing on its own과 같은 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 혈액 관련 배경 잡음이 제거되어 미세 전이의 검출 능력이 상당히 향상되었다는 점입니다.

약 150 µL의 PBS에 녹인 케타민, 자일라진 및 아세프로마진을 복강 내 주사하여 마우스의 마취를 유도함으로써 프로토콜을 시작합니다. 마우스의 통증 반사가 더 이상 관찰되지 않으면 수술대 위에 고정합니다. 뒷부분을 아래로 향하게 한 뒤 70% ethanol로 털을 매끄럽게 정리합니다.

복부에서 목까지 피부를 절개합니다. 피부를 양옆으로 당기거나 제거하십시오. 경정맥과 같은 큰 혈관의 파열을 방지하기 위해 흉강의 복막을 조심스럽게 절개합니다.

이렇게 하면 관류 효율이 향상됩니다. 이제 21-24 gauge 바늘이 장착된 20 milliliter 주사기를 사용하여 간 아래의 vena cava cardis를 절단하십시오. 뛰고 있는 심장의 우심실에 10-15 milliliters PBS를 천천히 주입하여 폐가 완전히 하얗게 변하고 심장 박동이 멈출 때까지 계속합니다.

그 다음 혈관 클램프를 사용하여 간과 횡격막 위의 혈관을 집어 차단합니다. 10 mL 주사기에 3% paraform aldehyde를 채우고, 21~24 gauge 바늘을 사용하여 우심실에 약 2 mL를 주입합니다.

흉곽 외부에서 기관을 노출시키고, 흉곽 외부에서 기관 내로 알데히드 약 3 mL를 주입하여 폐를 팽창시킵니다. 그 후 바늘을 제거한 즉시 혈관 클램프로 천자 부위에 인접한 기관을 집어 고정하고, 고정이 이루어질 때까지 10분 동안 기다립니다. 다음으로, 혈관 클램프 윗부분의 혈관들을 절단합니다.

그런 다음 클램프를 제거하고 우심실에 PBS 약 2 mL를 주입하여 과량의 파라포름알데히드를 제거합니다. 바늘로 모든 폐엽의 하단을 찌르고 기관에 있는 혈관 클램프를 제거합니다. 이제 다른 주입 단계와 마찬가지로 희석된 매립액 3~5 mL를 기관에 주입합니다.

폐엽 내의 파라포름(paraform)이 용액으로 대체되면 주입을 중단합니다. 핀셋으로 심장을 당기고 결합 조직 인대, 혈관 및 기관을 절단하여 폐를 조심스럽게 제거합니다. 이때 심장이 폐에 연결된 상태를 유지해야 합니다.

한 개의 엽은 동결 절편 제작을 위해 따로 떼어 두고, 나머지 폐 조직은 전체 염색에 사용합니다. 밀폐 뚜껑이 있는 플라스틱 컵에 폐를 넣고 2% formaldehyde와 PBS로 고정합니다. 폐가 용액에 잠겨 있도록 위에 거즈를 덮어 실온에서 30분 동안 둡니다.

30분 후, 고정액을 제거하고 PBS로 조직을 3회 충분히 세척합니다. Xal 스톡 솔루션 1 mL를 기본 염색액에 1:40 비율로 희석하여 즉시 사용 가능한 Xal 솔루션을 조제하고, 이를 컵에 최소 10 mL 넣습니다. 거즈 조각을 이용하여 폐 조직을 담급니다. 공기 교환이 가능하도록 뚜껑을 느슨하게 닫고, 빛이 차단된 상태에서 37 °C로 3~5시간 동안 배양합니다.

배양 후, xal 용액을 제거합니다. 잔류 xal 용액을 제거하기 위해 PBS로 폐를 한 번 헹군 다음, PBS에 희석된 4% paraform aldehyde 10 mL 이상을 첨가합니다. 이제 조직은 조직학 분석 준비가 완료되었으며, 4 °C의 4% PFA에 장기간 보관할 수 있습니다.

먼저 임베딩 몰드의 3분의 1을 희석하지 않은 poly forze 임베딩 매질로 채웁니다. 그다음 폐엽을 몰드에 넣고, 폐엽이 완전히 덮일 때까지 매질을 계속 추가합니다. 이때 기포가 생기지 않도록 주의하며, 임베딩된 폐엽을 4 °C에서 20분 동안 배양합니다.

다음으로, 드라이아이스와 이소펜테인 혼합물에서 천천히 동결시켜 포매된 폐를 절편 제작이 가능하도록 준비합니다. 필요한 경우, 이를 -80 °C 냉동고로 옮겨 보관할 수 있습니다. 크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 폐엽의 7~10 µm 두께의 동결 절편을 제작하고, 이를 시중에서 판매되는 동결 절편 전용 슬라이드에 부착합니다. 부착 후, 즉시 가습 챔버 내에서 37 °C의 xal 염색액으로 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, PBS로 슬라이드를 5분씩 2회 헹굽니다.

이어서 증류수로 짧게 헹굽니다. 이제 핵 전용 패스트 레드(nuclear fast red)로 슬라이드를 10초 동안 대조 염색하여 xal이 더 두드러지게 보이도록 약하게 염색한 후, 즉시 증류수로 대조 염색액을 헹굽니다. 더 진한 대조 염색을 원할 경우, 시간을 30초 또는 그 이상으로 연장하십시오.

면역 마운팅 용액을 사용하여 슬라이드를 마운팅합니다. done LM eight 마우스 OS 모델에서 전이 형성 여부를 재조사했습니다. laxy가 형질전환된 세포와 형질전환되지 않은 대조군 done 및 LM eight 세포를 동시에 주입한 마우스, 그리고 대조군 done 세포만을 주입한 마우스의 관류 및 비관류 폐에서 얻은 대표 이미지를 사용하여 여기에 기술하였습니다.

비관류 및 관류 폐에서 거시적 및 미세 전이는 검출되지 않은 상태로 남아 있었습니다. 하지만 흥미롭게도 dun LA Z 세포가 주입된 생쥐의 경우, xgl 염색을 통해 비관류 폐 표면에서 단일 세포 또는 소규모 세포 군집으로 이루어진 푸른색 미세 전이 초점이 확인되었습니다. 폐의 in situ 관류 및 고정은 dun la z 미세 전이의 검출 능력을 더욱 향상시켰으나, 대조군인 LM eight 세포가 주입된 생쥐에서는 거시적 초점으로의 성장이 관찰되지 않았습니다. 비관류 폐에서는 직경 0.1 millimeter 이상의 반투명하고 거의 검출하기 어려운 거시 전이 초점이 인식되었습니다. 폐 관류는 이러한 초점의 검출 능력을 향상시키지 않았습니다.

그러나 LacZ 세포를 주입한 마우스의 경우, 관류되지 않은 장기 표면에서 X-gal 염색으로 푸르게 나타나는 다수의 거대 전이 병변이 검출되었습니다. 또한, 관류되지 않은 장기 표면에서 미세 전이 병변도 검출되었습니다. 더욱이, 폐 관류를 시행했을 때 거대 및 미세 전이의 검출 능력이 더욱 향상되었습니다.

결과적으로, 관류된 조직의 투명도 덕분에 장기 표면 아래의 병소들도 관찰 가능해졌으며, 이에 따라 미세 및 거대 전이 병소가 더 높은 밀도와 더 많은 수로 나타났습니다. 폐 조직의 동결 절편을 이용한 추가 조직학적 분석을 통해, LAX Z가 형질전환된 Dun 및 LM8 세포를 주입한 마우스와 Dun LAX Z 세포 유래의 원발성 종양을 가진 마우스에서 폐 전이의 검출 능력이 향상되었음을 확인하였습니다. 폐 절편에서 미세 전이 또는 단일 세포 병소까지 식별되었습니다.

이는 각각의 대조군 세포로 일차 종양을 형성한 생쥐에서는 관찰되지 않았습니다. 또한, LM eight LA C 세포를 주입한 생쥐는 대조군 LM eight 세포를 주입한 동물보다 거시 전이가 더 명확하게 관찰되었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 ZI 2에서 폐 관류 및 고정법을 수행하는 방법과 절제된 폐에서 전이 부위를 exci 염색하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

이 기술은 모든 종류의 암 연구에서 폐 내 전이 분포를 확인하는 매우 민감한 최종 시점 판독법이며, 전이성 병변의 조기 진단에 사용되는 micro CT, PET 및 MRI와 같은 현재의 생체 내 영상 기술의 개선을 위한 벤치마크로도 활용될 수 있습니다.