Phagokinetic 트랙 운동성 분석에 의한 세포 마이그레이션의 수량 평가

이 실험 절차의 전반적인 목적은 금 나노입자 기반의 세포 이동성 분석법을 사용하여 시간에 따른 세포 이동성을 정량적으로 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 금 나노입자를 코팅하기 위한 유리 커버슬립을 준비합니다. 구체적으로, 엔도톡신 제거 커버슬립에 젤라틴을 코팅한 후 가열 건조합니다.

두 번째 단계는 염화금산을 환원시켜 금 나노입자를 생성하고, 젤라틴이 코팅된 커버슬립을 해당 용액으로 균일하게 코팅하는 것입니다. 다음으로, 실험 세포의 설정된 시간 동안 금 나노입자가 코팅된 커버슬립 위에 세포를 배치합니다. 이어서, 젤라틴이 금 나노입자를 밀어내어 트랙을 생성하게 됩니다.

마지막 단계는 현미경을 사용하여 이동하는 세포가 생성한 궤적을 촬영함으로써 세포 운동성을 모니터링하고 정량화하는 것입니다. 최종적으로, 무료 소프트웨어를 사용하여 궤적의 면적 측정을 수행합니다. 타임랩스 이미징과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점 중 하나는 표준 광학 현미경과 표준 카메라만 필요하며, 무료 이미징 소프트웨어를 사용한다는 점입니다.

또한, 이 분석법은 고처리량 스크리닝이 가능한 방법을 통해 여러 시료의 분석과 비교를 용이하게 합니다. 이 방법은 다양한 생리적 요인과 세포 이동의 영향에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 병원균이 감염된 세포의 운동성에 미치는 영향에 대한 연구와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 사용자는 프로토콜에 명시된 부피와 온도를 엄격하게 준수해야 하므로 어려움을 겪을 수 있습니다.

본 프로토콜에서는 성공 여부를 확인하기 위해 침전된 금 나노입자 최종 용액의 색상을 평가하는 것에 중점을 둡니다. FGO 키네틱 트랙 운동성 분석 단계는 습득하기 어렵기 때문에, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다.

여기에는 세포 및 분자 생물학 실험실에서 흔히 사용되지 않는 몇 가지 절차가 포함되어 있습니다. 젤라틴 코팅 커버슬립을 준비하려면, 먼저 젤라틴과 탈이온수를 재현탁하여 최종 농도가 300 mL당 0.5 g인 용액을 만든 후, 혼합물을 15분에서 30분 동안 오토클레이브 처리합니다. 이 과정은 조직 배양 후드 내에서 젤라틴을 첨가한 후 2시간 이내에 수행하는 것이 중요합니다.

먼저 산 세척된 커버슬립 8~9개를 100mm 플라스틱 디시에 옮겨 코팅 준비를 합니다. 커버슬립들이 서로 닿거나 디시 벽면에 닿지 않도록 주의하십시오. 각 커버슬립 위에 젤라틴 2~3방울을 조심스럽게 피펫팅하며, 플레이트에 넘치지 않도록 주의합니다.

그다음 젤라틴이 코팅된 커버슬립이 담긴 디시를 오븐에 넣고 90 °C에서 10분 동안 가열합니다. 10분 후, 오븐에서 디시를 꺼내 조직 배양 후드로 다시 옮깁니다.

과량의 젤라틴을 피펫으로 조심스럽게 제거합니다. 접시를 다시 오븐에 넣고 커버슬립을 70 °C에서 45분 동안 건조시킵니다. 커버슬립이 건조되면 접시를 오븐에서 꺼내 조직 배양 후드로 옮깁니다.

멸균된 바늘을 사용하여 조심스럽게 커버슬립의 한쪽 끝을 들어 올립니다. 그 다음, 멸균 핀셋으로 젤라틴이 코팅된 커버슬립을 디쉬에서 제거하여 24웰 플레이트의 각각 다른 웰에 넣습니다. 다음 단계는 콜로이드 금이 코팅된 커버슬립을 준비하는 것입니다.

조직 배양 후드 내에서 1.5 mL의 14.5 mM 클로로 ORIC 산 용액과 13.5 mL의 오토클레이브 멸균 탈이온수를 멸균된 엔도톡신 프리 삼각 플라스크에 혼합하여 0.5% 시트르산 나트륨 용액 10 mL를 준비하는 것으로 시작합니다. 커버슬립 8~9장당 결과물은 옅은 노란색 용액이어야 합니다. 클로로 ORIC 산은 독성이 있으므로 주의해서 다뤄야 합니다. 또한 빛에 민감하므로 가열 단계는 낮은 조도 환경에서 수행해야 합니다.

용액이 끓는점에 도달하면, 플라스크를 핫플레이트에서 분리하여 교반기에 옮깁니다. 용액 내에 콜로이드 금 입자를 형성하기 위해, chloro ORIC acid 용액 15 mL당 0.5% sodium citrate 용액 0.7 mL를 교반하면서 첨가하고, 약 2분 동안 계속 교반합니다. 이 과정 동안 용액의 색상은 옅은 노란색에서 투명색, 회색, 보라색을 거쳐 진한 보라색으로 변합니다.

최종적으로 레드 와인 또는 가급적 녹슨 쇠 색상이 되기 전에, 콜로이드 금 용액을 10 milliliter 피펫으로 흡입하고 용액이 실온에 도달할 때까지 피펫 내에서 1~2분 동안 식힙니다. 그 다음 24-웰 플레이트의 젤라틴 코팅 커버슬립 위에 0.5~1 milliliter를 첨가합니다. 콜로이드 금이 도포된 커버슬립이 들어있는 24-웰 플레이트를 37 °C 인큐베이터에 넣고 30분 동안 배양합니다. 입자들이 젤라틴 코팅 커버슬립 위에 가라앉을 시간을 준 후, 광학 현미경으로 밀도를 확인합니다.

금 나노입자의 적절한 분포는 솔라 트랙(solar trucks)의 가장자리를 쉽고 효율적으로 구별하는 데 도움이 됩니다. 최적의 밀도는 세포 크기에 따라 달라집니다. 금 입자의 농도가 너무 높으면 세포의 이동 능력이 저해되며, 금 입자의 농도가 너무 낮으면 운동성의 정확한 궤적을 묘사하는 능력이 제한됩니다.

이러한 이유로, 개별 실험에서는 동일한 배치에서 제작되었거나 동일한 밀도를 갖도록 최적화된 커버슬립만을 함께 사용해야 합니다. 금 입자의 농도가 불충분한 경우, 젤라틴이 코팅된 커버슬립에 콜로이드 금 용액을 0.5에서 1 mL 더 추가하십시오. 그러나 여기에 표시된 경우처럼 금 입자의 농도가 너무 높다면, 콜로이드 금 용액을 다시 제작하고 새로운 커버슬립을 코팅하는 것이 유일하고 효과적인 방법입니다.

입자 밀도가 적절하다면, 플레이트를 37°C 인큐베이터로 다시 옮겨 1시간에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 이후 커버슬립을 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)에 세 번 담가 결합되지 않은 금 입자를 씻어냅니다. 그 다음, 콜로이드 금이 코팅된 커버슬립을 깨끗한 12웰 플레이트의 PBS가 채워진 웰에 넣고 4°C에서 사용 시까지 보관하십시오. 커버슬립이 마르지 않도록 주의해야 하며, 제작일로부터 2~3개월 이내에 사용해야 합니다.

다음 단계는 세포 배양을 위해 콜로이드 금이 코팅된 커버슬립을 준비하는 것입니다. 먼저 커버슬립을 추가하기 전에 약 0.3 milliliters의 배양액이 들어 있는 24-well 플레이트의 개별 웰에 커버슬립을 넣습니다. 각 콜로이드 금 코팅 커버슬립 위에 약 5,000에서 50,000개의 세포를 옮깁니다. 세포 수는 세포 종류에 따라 다르지만, 동일한 영역 내에서 여러 세포의 이동 경로가 겹치는 것을 방지하기 위해 세포 밀도를 충분히 낮게 유지해야 합니다.

플레이트를 덮고 37°C, 5% CO₂ 조건의 배양기에 넣어 6에서 24시간 동안 배양합니다. 세포 유형의 운동성에 따라 최적의 배양 시간은 각 세포 유형별로 실험적으로 결정해야 합니다. 배양 후, 즉시 분석하지 않을 커버슬립은 먼저 PBS에 두 번 담근 다음, 실온에서 3% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 15분 동안 처리하여 고정합니다. 현미경을 사용하여 고정되지 않았거나 고정된 커버슬립 상에서 단일 이동 세포가 생성한 궤적의 이미지를 캡처합니다. 세포 궤적 사진 촬영에 사용되는 배율은 세포 유형에 따라 다르지만, 결과 비교를 위해 각 연구 내에서는 동일한 배율을 사용해야 합니다.

단핵구의 경우, ImageJ, JNIH image 또는 image tool과 같이 무료로 제공되는 소프트웨어를 사용하여 40배 배율로 관찰하는 것이 적절합니다. 캡처된 이미지에서 각 샘플당 10~20개 이상의 세포에 의해 제거된 콜로이드 금의 평균 면적을 측정하십시오. 여기에 제시된 이미지는 40배 대물렌즈로 촬영한 자극되지 않은 단일 단핵구에 의해 콜로이드 금 입자가 제거된 경로입니다. 운동성이 없는 세포는 주변에 특징적인 작은 타원형 또는 원형의 궤적을 형성하며, 이는 낮은 수준의 이동성을 나타냅니다. 반면, 운동성이 높은 세포는 불규칙한 형태와 더불어 길게 늘어난 궤적과 더 넓은 전체 면적으로 나타나는 방향성 이동이 특징입니다.

세포 궤적은 Image J 소프트웨어의 freehand 도구를 사용하여 부피를 외곽선으로 그려 분석하는 것이 가장 좋습니다. 이후 Image J의 분석 메뉴에 있는 measure 도구를 사용하여 정량적인 면적 측정을 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 오차가 최종 결과에 큰 영향을 미칠 수 있으므로 프로토콜에 명시된 부피와 온도를 엄격히 준수하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후, 젤라틴 코팅 커버슬립을 제작하는 방법, 금 나노입자와 금 나노입자 코팅 커버슬립을 준비하는 방법, 그리고 광학 현미경을 사용하여 세포 이동을 관찰하고 정량적으로 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

핫플레이트 위에서 끓는 용액을 다룰 때, 특히 fluoro, AIC acid 및 sodium citrate 끓는 용액에서 발생하는 증기는 위험할 수 있다는 점에 유의하십시오. 본 절차를 수행하는 동안에는 후드 내에서 작업하고 상식적인 주의 사항을 지키는 등의 예방 조치를 항상 취해야 합니다.