줄기 세포 기반 유전자 치료 종양 모델로 BLT 인간화 마우스를 사용하여

다음 실험의 전반적인 목적은 공학적으로 설계된 인간 면역 체계를 가진 마우스를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 수술을 위해 마우스를 준비한 다음, 두 번째 단계에서 트로카(trocar)에 흉선 조각을 삽입함으로써 달성됩니다. Matrigel을 CD 34 음성 및 CD 34 양성 형질전환 세포와 혼합한 후, 이 혼합물을 트로카에 추가합니다.

다음으로, 매트리젤 구조물을 신장 피막 아래에 이식합니다. 최종적으로, 유전자 조작된 CD8 T 세포에 의한 표적 종양의 거부 반응을 live PET 영상 촬영과 물리적 종양 측정으로 모니터링할 수 있습니다. 완전한 뉴런 모델과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 유전자 변형된 인간 줄기세포의 발달을 인간 흉선 내에서 연구하고, 이후 파생된 계통의 in vivo 효능 시험을 수행할 수 있다는 점입니다. 본 절차는 저희 연구실의 기술진인 Gregory Bristol, Bernard Levin, Sean Kim 세 명이 시연하겠습니다.

이 모식도에서는 mart1 특이적 T 세포를 보유한 키메라 마우스 생성을 위해 본 연구에서 사용된 변형된 BLT 모델이 설명되어 있습니다. 흉선 임플란트는 자가 태아 간에서 분리한 형질전환 및 비형질전환 CD34 세포로 재구성됩니다. 이후 형질전환 세포의 일부를 동결한 후 4~6주 뒤에 방사선 조사된 마우스에 주입합니다.

본 영상에서는 마취로 인해 동물이 둔해진 후 생체 내 construct를 이식하는 과정을 보여줍니다. 먼저 각 마우스의 왼쪽 엉덩이부터 어깨까지, 등 중앙과 복부 사이의 털을 깎으십시오. 각 동물의 체중을 기록한 후, 식별 번호를 위해 귀에 펀칭을 하고 각 어깨에 carprofen 0.3 milliliters를 피하 주사하십시오.

그런 다음 마우스를 왼쪽을 향하도록 오른쪽 옆으로 눕힙니다. 이제 라운드 파일 팁이 달린 16 gauge 암 이식 바늘의 트로카를 PBS로 세척합니다. 니들 노즈 포셉을 사용하여 흉선 조각을 PBS가 담긴 디시에 넣은 다음, 로드와 함께 트로카를 수평으로 잡습니다.

팁 바로 안쪽에서 조직을 흡입하십시오. 트로카를 신장 캡슐 아래로 밀어 넣고 조직을 주입하는 것은 이 절차에서 가장 까다로운 부분 중 하나입니다. 다음으로, 보조자의 도움을 받으십시오.

양압 변위 피펫을 사용하여 5 µL의 차가운 matrigel을 세포가 들어 있는 튜브 하나에 넣고 부드럽게 저어 섞습니다. 트로카(trocar)를 수평으로 유지하십시오. 보조자가 matrigel을 피펫팅하는 동안 로드를 천천히 뒤로 당깁니다.

각 마우스의 트로카(trocar)에 혼합합니다. 먼저 동물의 노출된 피부를 Betadine으로 닦아낸 후, 이소프로판올 솜으로 닦아냅니다. 피부 아래에서 가장 어두운 부분을 두 번 확인하여 비장의 위치를 결정합니다.

뭉툭한 핀셋(blunt forceps)으로 신장 위쪽의 피부를 들어 올려 확인하면, 비장에서 등쪽으로 약 5 mm 떨어진 위치에서 신장을 찾을 수 있습니다. 비장과 평행하게 피부를 약 15 mm 길이로 절개합니다. 그 아래의 복막 근육층도 동일하게 절개합니다.

수컷의 경우, 신장이 직접 보여야 합니다. 복부를 가볍게 눌러 신장이 밖으로 나오게 하십시오. 암컷의 경우, 왼손으로 복부를 계속 눌러 신장이 노출된 상태를 유지하면서, 먼저 지혈 겸자를 사용하여 난소를 잡은 다음 신장을 끌어내어 해당 장기가 체외에 유지되도록 합니다.

신장 캡슐의 후단에 작은 구멍을 낸 다음, 트로카를 이 구멍으로 밀어 넣어 트로카의 입구가 신장 캡슐에 완전히 덮일 때까지 신장을 따라 밀어 넣습니다. 그런 다음 오른손 새끼손가락을 사용하여 조직을 주입하십시오. 이제 닫힌 지혈鉗(hemostat)를 사용하여 신장을 조심스럽게 원래 위치로 밀어 넣습니다.

복막에 더블 보우(double bow) 방식으로 한 땀 꿰매어 피부를 주머니처럼 조여준 다음, 두 개의 상처 클립으로 고정합니다. 마지막으로 각 눈에 PBS를 한 방울씩 떨어뜨리고, 베딩이 깔린 케이지 안에 마우스를 옆으로 뉘어 놓습니다. 모든 마우스를 동일한 방식으로 이식한 후, 동물들이 다시 배를 대고 엎드린 자세로 돌아왔는지 확인한 뒤 종료합니다.

첫 번째 그림은 인간화 마우스 내 THI 생체 이식의 대표 이미지를 보여줍니다. 이 그림에서는 흉선 조직의 정상적인 발달과 인간 CD4 및 CD8 양성 T 세포의 생리학적 조직 분포가 입증되었습니다. 재구성에 따라, 동물들은 CD4 및 CD8 양성 T 세포가 정상적으로 분포된 인간 면역 체계를 갖게 됩니다.

여기에 흑색종 종양을 가진 마우스의 대표 이미지가 제시되어 있습니다. 회색 영역은 CT 스캔 이미지를 나타냅니다. 색상이 있는 영역은 PET 스캔으로 검출된 종양의 대사 활동을 나타냅니다.

본 실험에서 CT 스캔만으로는 흰색 원으로 표시된 영역에 거대한 종양 덩어리가 있는 것으로 나타났습니다. 그러나 in vivo PET 영상에서 알 수 있듯이, 이 영역은 대부분 괴사 조직과 흉터 조직으로 구성되어 있으며, 이는 종양의 퇴행 및 제거를 평가하는 데 있어 PET 영상이 더 민감하고 정확한 방법임을 강조합니다. 이 절차 이후에는 T-세포 기능과 관련된 의문에 답하기 위해 T-세포 분석, 표현형 분석 및 ex vivo 활성화를 포함한 다른 분석을 수행할 수 있습니다.