태아 쥐의 내장 장기에서 자율 신경 Progenitors의 형광 - 활성 셀 정렬 (FACS) 절연을위한 최적화된 절차

본 절차의 전반적인 목표는 말초 신경계 신경절로부터 정제된 신경 전구세포 집단을 얻는 것입니다. 이를 위해 먼저 태아 생쥐의 해당 장기 또는 특정 신경절을 적출합니다. 그런 다음 조직을 부분적으로 해리하여 개별 세포들이 주변 배지로 방출되도록 합니다.

다음으로, 잔류 조직 덩어리나 큰 응집물을 제거하기 위해 세포 현탁액을 여과합니다. 마지막으로, 해당 세포 집단의 형광 리포터 발현을 기반으로 관심 있는 세포 집단을 분리하기 위해 세포 현탁액을 유세포 분석기로 분리(flow sort)합니다. 결과적으로, 발달의 서로 다른 단계에서 분리된 전구세포 간 또는 서로 다른 신경세포 유형의 정제된 집단 간의 유전자 발현 패턴을 비교할 수 있습니다.

항체 표지에 기반한 세포군 분리 방식과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 면역 시약을 사용할 수 없는 경우가 많다는 점입니다. 특정 유전자를 발현하는 세포를 표지하는, 개별 신경세포 하위 집합에서 형광 단백질을 생성하도록 유전적으로 조작된 마우스 라인을 통해 이러한 세포군을 분리할 수 있습니다. 본 연구에서는 장과 입의 신경발생 경로에서 신경 전구세포를 분리하기 위한 이 방법을 입증하지만, 이는 형광 리포터를 발현하는 다른 모델 시스템에도 적용될 수 있습니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 소스 조직을 과하게 소화시켜 세포 생존율이 떨어지는 문제로 어려움을 겪는 경향이 있습니다. 해부 전, 명시야 조명을 통해 배아를 관찰하여 관련 구조들이 초점에 맞았는지 확인하십시오. 그런 다음, 형광 실체 현미경을 사용하여 형광 리포터의 발현 여부를 스크리닝함으로써 트랜스진 양성 배아를 식별하십시오.

안락사시킨 후, 배아가 조직 분리 중에 떠오르지 않도록 해부 접시에 최소량의 PBS를 추가하여 배아를 준비합니다. 체측면과 간 높이의 복부를 따라 배아의 피부를 절개합니다. 배아를 등으로 눕힌 뒤, 미세 핀셋을 사용하여 고정합니다.

앞다리 높이에서 횡격막 높이에 또 다른 포셉 한 쌍을 삽입한 후, 빠르게 내장 기관을 꼬리 쪽으로 당기면서 등쪽 체벽에서 떼어내어 간부터 생식결절까지의 내장물을 제거합니다. 심장이나 폐와 같은 흉강 내 기관이 내장물에 붙어 함께 나왔을 경우, 다음 단계를 진행하기 전에 해당 기관들을 제거하십시오.

복부 내장을 사체에서 분리한 후, 위 근처의 간 아래에 핀셋을 넣어 간을 장에서 조심스럽게 떼어냅니다. 그런 다음 후장을 배측 요도에서 조심스럽게 박리하여 생식비뇨관에서 장을 제거합니다. 마지막으로 장을 뒤집어 위 아래에 비장이 보이도록 합니다.

비장과 췌장을 제거합니다. 장간막을 잡고 장관 고리를 서로 떼어냅니다. 그 다음, 장간막을 가볍게 당겨 장간막과 그에 부속된 혈관들을 장에서 벗겨냅니다.

포셉으로 장을 직접 잡지 않도록 주의하십시오. 장이 끊어진 경우, 해리 단계에서 분리된 조각들을 함께 모으십시오. 조직 유형 및 배아 표현형 유형에 따라, 얼음처럼 차가운 HBSS가 담긴 15 milliliter 원추형 튜브에 각 조직 유형별로 함께 모으십시오.

펠렛팅 후, 미세 절제된 조직에서 가능한 한 많은 HBSS를 흡입하여 제거합니다. 그 다음, 조직 펠렛을 1~수 mL의 ACU max에 재현탁합니다. 각 샘플 사이에는 피펫 팁을 교체하십시오.

조직 유형 간의 교차 오염을 방지하기 위해, 튜브를 37 °C 항온수조에 20~45분 동안 넣어둡니다. 분리하려는 조직의 단계에 따라, 조직의 과도한 해리를 방지하여 세포 생존율이 낮아지는 것을 막으려면 조직의 해리 및 여과 과정이 이 절차에서 가장 까다로운 부분입니다.

해리 시간을 제한하고, 중간 단계에서 모든 조직 조각을 완전히 해리시키려 하지 마십시오. 해리 시간이 끝나면 튜브를 워터배스 옆면에 강하게 부딪히고 손목을 스냅 하듯 아래로 튕겨 조직을 수동으로 분쇄하십시오. 이제 해리된 샘플을 얼음 위에 옮기고, 각 샘플마다 새로운 피펫 팁을 사용하여 갓 준비한 퀀치(quench) 용액 1 mL를 각 튜브에 즉시 추가한 후, 조직이 거의 완전히 해리될 때까지 샘플을 파이펫팅하여 섞어주십시오.

이제 에탄올로 멸균한 핀셋을 사용하여, 38 µm 나일론 메쉬 멤브레인을 3 cm 정사각형 크기로 잘라 새로운 15 mL 원추형 튜브 입구에 덮습니다. 그런 다음 좁은 구경의 팁을 사용하여 개별적으로 재부유시킨 세포 용액을 멤브레인 중앙에 피펫팅하여 메쉬를 통해 여과합니다. 세포 현탁액의 여과가 완료되면, 샘플 튜브를 1 mL의 quench 1:5로 헹구고 남아 있는 세포를 모두 여과합니다.

그다음, 필터링되지 않은 조직 샘플이 튜브 내부로 들어가지 않도록 주의하며 멤브레인을 제거합니다. 펠릿화 후, 세포 현탁액의 상층액을 흡입 제거하고 펠릿을 1 mL의 quench 1-5에 재현탁합니다. 그런 다음, 방금 보여드린 것처럼 각 세포 현탁액을 나일론 메쉬를 통해 5 mL 폴리스티렌 튜브에 필터링합니다.

먼저 EGFP 단독 보정 대조군을 위해 형광 시료의 소량을 따로 분리해 둡니다. 그다음 야생형 조직 시료를 두 부분으로 나누어 하나는 야생형 단독으로, 다른 하나는 seven A a d.Only로 표시합니다. 이제 모든 시료 튜브에 quench 1~5를 채우고, 시료를 펠렛화한 후 각 튜브에서 마지막 200 µL의 상층액만 남기고 모두 흡입하여 제거합니다.

마지막으로, 분리할 샘플과 7-AAD 단독 대조군에 7-AAD를 첨가합니다. 그런 다음 1.5 mL 마이크로 원심분리관에 triazole LS 0.75 mL를 넣습니다. 샘플 수집 튜브를 준비하고, 대조군 샘플을 사용하여 보정 파라미터와 게이트를 설정함으로써 7-AAD 양성인 사멸 세포를 배제하고 GFP 형광 강도가 높은 세포를 수집하기 시작합니다.

보정 파라미터를 설정한 후, 넓은 구경의 노즐과 낮은 유속을 사용하여 가능한 가장 낮은 압력에서 소팅을 시작하십시오. triol LS가 과도하게 희석되지 않도록 각 마이크로 원심분리 튜브에 최대 25,000개의 세포를 수집하십시오. 소팅 직후 triol LS에 포집된 각 세포 튜브를 볼텍싱하십시오.

첫 번째 그림에서는 명시야 조명 하에서 복측으로 관찰한 수정 후 15.5일 된 유로 생식관 전체 마운트 표본을 보여줍니다. 동일한 샘플을 형광 조명 하에서 관찰하여, TH EGFP 트랜스진 발현으로 확인된 부신 및 중앙에 위치한 복강 신경절 내 EGFP 양성 세포의 분포를 나타냅니다. 수정 후 15.5일 된 TH EGFP 미세 절제된 방광의 이 측면도는 골반 신경절, 방광벽 및 요도에서의 트랜스진 발현으로 인한 형광을 보여줍니다.

동일한 세포의 배측 뷰에서 EGFP 양성 세포들이 전방 배측 요도 조직에서 분명하게 관찰됩니다. 유세포 분석 분리를 위한 세포 현탁액을 만들기 위해 조직을 해리하는 과정에서는 적절한 효소 소화와, 세포 생존율을 낮출 수 있는 과도한 소화를 방지하는 것 사이의 정밀한 균형이 필요합니다. 이 광학 현미경 사진들은 해리 시간의 중간 단계에 있는 하부 생식기 및 장 조직을 보여줍니다. 적절하게 소화된 조직의 수동 처리 전후 사진에서 볼 수 있듯이, 효소 처리 시간이 너무 길거나 효소 농도가 너무 높을 경우 미세 절제된 장기 조각들이 조직 내에 여전히 뚜렷하게 남아 있습니다.

그러나 결과물인 현탁액에는 잔류하는 큰 조직 조각이 없어야 하며, 적절한 해리 및 수동 여과를 거치면 일반적으로 90% 이상의 생존 세포를 나타내는 유세포 분석 프로파일이 생성됩니다. 이 생존 세포 집단 내에서 리포터를 발현하는 세포들은 높은 강도의 EGFP 발현을 유지합니다. 검은색 집단은 죽은 세포들로 구성되며, 7-AAD 형광 염료의 흡수에 의해 표지된 단일 세포들입니다. 회색 집단은 전방 산란광 및 측방 산란광을 기준으로 단일 세포들로 구성되며, 7-AAD가 배제되어 생존한 상태입니다.

녹색 세포군은 게이트 설정된 GFP 양성 영역에서 유래하며, 7-AAD를 배제하고 EGFP 형광을 나타내는 단일 생존 세포들로 구성됩니다. 이 절차를 통해 교감신경쇄, 후근 신경절 또는 폐와 같은 다른 말초 조직으로부터 신경 전구세포를 분리함으로써, 세포군 간의 유전자 발현 프로파일 차이나 서로 다른 계통의 발달에 관한 질문에 대한 해답을 얻을 수 있습니다.