Lipoaspirate에서 수확 지방 - 파생 Stromal 셀을 사용하여 임계 크기 Calvarial 결함 모델의 수리

본 실험 절차의 전반적인 목표는 생쥐의 체내 두개골 결손 모델을 이용하여 골분화를 유도하기 위해 지방 조직으로부터 다능성 기질 세포를 수확하는 것입니다. 이를 위해 먼저 지방 흡입술을 통해 얻은 지방 조직의 기질 혈관층에서 전구 세포를 분리합니다. 다음 단계로 3차원 지지체를 제작한 후, 해당 지지체에 세포를 파종합니다.

마지막 단계는 스캐폴드와 세포를 배치할 쥐 모델의 임계 크기 두개골 결손 부위를 생성하는 것입니다. 최종적으로, 지방 조직에서 분리된 다능성 기질 세포가 생체 내 골 재생 가능성을 가지고 있음을 보여줍니다. 이 기술은 골 재생에 사용할 수 있는 조직의 부족으로 인해 광범위한 임상 적용 가능성을 가지고 있습니다.

자가골 이식술이 표준 치료법으로 간주되지만, 공여 부위의 부족과 공여 부위의 이환율로 인해 이 방법의 사용이 제한적입니다. 동종이식물이나 외래 재료를 사용할 수 있으나, 이는 비용 문제, 낮은 통합력 및 잠재적인 감염 위험이라는 한계가 있습니다.

골격 조직 공학을 위한 전구 세포 분리용으로 지방 조직을 사용할 수 있다는 점은 매우 흥미로운 일입니다. 이 절차에 대한 시연은 저와 long anchor 실험실의 Michael Chung이 진행하겠습니다. 먼저, 선택적 지방 흡입술을 통해 인간의 피하 지방 조직을 확보합니다.

흡입된 지방 조직에서 두 개의 층이 형성된 것을 확인하십시오. 상층액에는 대부분의 세포성 물질이 포함되어 있으며, 하층은 주로 주입된 생리식염수입니다.

지방 유래 기질 세포는 두 층 모두에서 수확할 수 있으나, 상층액에서의 수율이 훨씬 더 높습니다. 기질 혈관 분획 또는 SVF를 분리하려면, 2.5% Betadine이 포함된 1x 인산완충식염수(PBS)를 동일한 부피로 사용하여 지방 흡입물을 충분히 세척한 후, Betadine이 없는 1x PBS를 동일한 부피로 사용하여 다시 흡입 세척하십시오. 세척 후 침전될 때까지 기다립니다.

처리된 인체 조직으로 인한 오염을 방지하기 위해 전 과정 동안 멸균 기술을 철저히 유지하십시오. 다음으로, 각 세척 단계 후 하층액을 흡입하여 제거하십시오. 그 후 15 mL의 지방 조직을 50 mL Falcon 원심 분리 튜브에 넣습니다. 이어서 15 mL의 여과된 0.075% filtered 용액으로 지방 조직을 용해하십시오.

37°C의 항온수조에서 지속적으로 교반하며 Hank's balance salt solution(HBSS)에 2형 콜라게나제(type two collagenase)를 처리하여 60분 동안 반응시키되, 15분마다 튜브를 환기시켜 줍니다. 그 후 10% fetal bovine serum(FBS)이 포함된 PBS 15 mL를 가해 효소 활성을 중화시키고 원심분리합니다. 고밀도의 SVF 펠렛을 얻으면, 이 펠렛은 지방 유래 줄기세포와 적혈구가 혼합된 상태가 됩니다.

먼저 상층의 지방층을 제거한 다음, 펠렛이 흐트러지지 않게 주의하며 상층액을 제거하십시오. 펠렛을 10 milliliters의 일반 배지에 다시 현탁합니다. 그 후, 100 micron 필터를 통해 세 개의 튜브 내용을 하나의 깨끗한 50 milliliter 원심분리관(conical tube)에 합친 뒤 원심분리하십시오.

펠렛이 손상되지 않도록 상층액을 제거한 다음, 펠렛을 재부유합니다. 일반 배양 배지 5 mL를 사용하여 10 cm 플레이트당 50 mL 원뿔형 튜브 2개, 또는 15 cm 플레이트당 5 mL 원뿔형 튜브 5개를 준비하여 혼합합니다. 37 °C, 21% 산소 및 5% 이산화탄소 조건에서 하룻밤 동안 1차 배양을 수행합니다.

밤새 배양한 후, PBS로 플레이트를 세척하여 부착되지 않고 남아 있는 적혈구를 제거합니다. 이렇게 얻은 세포군은 지방 유래 중간엽 줄기세포입니다. 자발적인 분화를 방지하기 위해 세포를 sub-confluent 상태로 유지하십시오.

37 °C, 21% 산소 및 5% 이산화탄소 조건에서 배양합니다. 성장 배지 내에서 세포는 일반적으로 3~4일마다 정기적인 성장 배지로 분할 배양해야 합니다. 50% 합류도(confluence)로 도말되었을 때, 동반된 원고에 설명된 대로 스캐폴드를 준비합니다.

세포가 하합류(sub confluence) 수준에 도달하면, PBS로 세포를 두 번 세척하고 트립신 처리합니다. 세포 수를 세어 정량합니다. 파종을 위해, 직경 4mm로 미리 절단된 스캐폴드에 1.5 × 10⁵ 개의 세포를 파종할 준비를 합니다.

개별 스캐폴드를 96-웰 플레이트의 한 웰에 넣은 다음, 배지 20 µL당 약 1.5 × 10⁵ cells 농도의 일반 성장 배지로 세포를 재현탁합니다. 20 µL의 현탁액을 스캐폴드에 직접 피펫팅하여 세포를 접종하고, 이를 세포 배양 인큐베이터에 30분 동안 둡니다.

30분 후, 배지 200 µL를 추가하고 세포를 스캐폴드 위에서 하룻밤 동안 배양합니다. 수술 전, 세포 파종 시와 같이 세포가 스캐폴드에 부착되었는지 확인할 필요는 없습니다. 충분한 수의 세포를 사용하면 대부분의 세포가 스캐폴드에 부착될 것입니다.

60일령의 성체 CD one 누드 마우스를 마취시킨 후, 수술 부위를 베타딘과 알코올로 3회 멸균하고 마우스의 눈에 윤활제를 도포합니다. 그 후 마우스 두피에 정중선 시상 절개를 가하여 오른쪽 두정골을 노출시킵니다. 무딘 도구로 긁어내어 오른쪽 두정골에서 골막을 제거합니다.

다음으로, 오른쪽 비봉합 부위의 두정골에 4 mm 크기의 편측 전층 결손을 생성합니다. 마우스 두개골의 두께는 이식 전 0.3 mm 미만이므로, 다이아몬드 코팅 틴 드릴 비트를 사용할 때 하부의 경질막이 손상되지 않도록 각별히 주의하십시오. 배지 유래 성장 인자의 전이를 방지하기 위해 스캐폴드를 멸균 PBS로 헹굽니다.

스캐폴드를 결손 부위에 배치합니다. 마지막으로, 피부를 봉합하고 정해진 수술 후 프로토콜에 따라 동물을 모니터링합니다. 마우스에 대해 micro CT를 수행하고 microview 소프트웨어를 사용하여 3D 재구성 이미지를 얻습니다.

Adobe Photoshop을 사용하여 이미지 크기를 표준 높이로 조정합니다. 일반적으로 우리는 2주마다 두개골 재생 상태를 측정합니다. 장기 추적 관찰을 위한 스캔 과정 동안 마우스는 마취 상태를 유지하며, 최종적으로 안락사시킵니다.

조직학적 분석을 위해, 마술봉(magic wand) 기능을 사용하여 두개골 결손 부위의 픽셀을 측정하십시오. 이후 CT 스캔을 통해 결손 부위의 치유 백분율을 결정하십시오. 두개골 결손 면적을 측정하여 픽셀 수를 결정하고 이를 원래 결손 부위의 픽셀 수로 나누십시오. 골 형성을 나타내기 위해 aniline blue 및 pen aro와 같은 조직학적 염색법을 사용하여 결손 범위 전체에 걸쳐 여러 단면을 염색하십시오.

Adobe Photoshop을 사용하여 두개골 결손 부위가 아닌 모든 영역을 잘라내고, 마술봉 도구를 사용하여 결손 부위 내 신생 골 형성의 픽셀 수를 측정하며, 이를 대조군 또는 다른 변수와 비교하십시오. 다음은 지방 유래 기질 세포의 분리부터 확장, 분화, 그리고 in vitro 및 in vivo 활용까지의 지방 흡입물 채취 및 적용 과정에 대한 개요입니다. 하단 행에는 하이드록시아파타이트 스캐폴드를 통해 ASC를 적용하여 임계 크기 두개골 결손 부위가 in vivo에서 치유되는 모습을 보여주는 micro CT 영상이 있습니다.

상단 행에 표시된 대조군은 스캐폴드와 결손이 없는 경우를 포함합니다. 중간 행은 세포가 없는 스캐폴드를 배치한 결손 상태를 보여줍니다. 여기에 제시된 LS는 micro CT를 통한 골 치유의 정량적 분석 결과이며, A SC 그룹에서 치유가 유의하게 증가했음을 보여줍니다.

이것은 andal을 통해 A SC 그룹의 골 형성 증가를 보여주는 조직학적 이미지입니다. 파란색은 al에 대한 pen AROM 염색을 나타냅니다. 파란색으로 표시된 부분에서 osteoid는 pen arom에 의해 진한 파란색으로 염색됩니다.

여기에 제시된 노란색으로 염색된 유골(osteoid)은 GFP로 표지하여 스캐폴드에 파종한 후 2주 후에 희생시킨 인간 ASCs입니다. 결손 부위의 재생에 기여하는 인간 세포를 보여주기 위해 GFP 표지 항체로 염색을 수행하였습니다. 여기에는 2주 차 결손 부위에서 인간 세포의 우세함을 보여주는 인간 핵 항원 면역조직화학 염색 결과가 제시되어 있습니다.

숙달되면 지방 조직 처리는 4시간 이내에 완료할 수 있으며, 수술 절차는 마우스 한 마리당 약 10분이 소요됩니다. 두개골의 두정골은 둥근 반면 드릴은 평평하므로, 4 mm 결손 부위의 전체 둘레를 모두 뚫을 수 있도록 주의해야 한다는 점을 기억하십시오. 뇌의 경막을 손상시키지 않도록 천천히 진행하시기 바랍니다.

이 영상을 시청한 후, 지방 조직에서 전구 세포를 분리하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 세포들을 지지체에 파종한 후 마우스에 이식하십시오.