라이브 세포 형광 현미경을 사용하여 박테리아 독소 유도 응답의 시각화

이 절차의 목적은 세균 독소에 대한 면역 세포의 반응을 시각화하는 것입니다. 먼저, BL 21 gold 세포에서 독소를 발현시키고 정제합니다. 독소의 활성과 농도가 확인되면, 해당 독소를 면역 세포에 전달합니다.

마이크로 인젝터와 고속 라이브 셀 현미경 촬영을 수행합니다. 결과 이미지 분석을 통해 독소에 대한 면역 세포 반응의 실시간 키네틱스를 확인할 수 있습니다. 이 방법은 인플라마좀 활성화 메커니즘과 같이 면역학 분야의 핵심적인 질문들에 대한 해답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다.

이 방법은 독소로 매개되는 면역 세포 반응에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 화학 유인 물질을 포함한 다른 자극에도 적용될 수 있습니다. 우리는 배양된 면역 세포와 박테리아의 상호작용을 연구하던 중 박테리아와 면역 세포 사이에 매우 가변적인 상호작용이 관찰되는 것을 보고 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. pAG3-SLO가 포함된 BL 21 gold 세포 배양을 통해 strep lysin O 또는 SLO 정제를 시작하십시오.

His 플라스미드를 OD 약 0.6까지 배양합니다. 단백질 발현을 유도하기 위해, 배양액에 20% OSes 5 mL를 첨가하고 실온에서 225 RPM으로 3시간 동안 진탕 배양합니다. 그런 다음, 박테리아를 500 mL 원심분리 병으로 옮깁니다.

그 후 배양액을 4°C에서 12,000 ×g로 12분간 원심분리한 다음, 상층액을 제거합니다. 펠렛을 -80°C에서 하룻밤 또는 필요에 따라 더 오래 보관합니다. 발현된 SLO를 정제하려면 Triton X 100, 라이소자임 및 phenyl methyl sulfuryl fluoride가 첨가된 ly wash buffer 10mL를 냉동 펠렛에 넣고 약 15분 동안 피펫팅하여 섞어줍니다.

재현탁을 위해 샘플을 얼음에 둔 상태로 펠렛을 현탁합니다. 재현탁된 펠렛을 50 milliliter oak ridge 라운드 바텀 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다. 프로브 초음파 분쇄기를 사용하여 40% 출력으로 30초간 5회 초음파 처리하며, 각 처리 사이에는 30초의 간격을 두고 30초 동안 얼음에 둡니다.

그 후 초음파 처리된 용해물을 4°C에서 39,000 ×g로 20분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 박테리아 상층액을 1 mL의 세척된 니켈 NTA agarose에 첨가합니다. 니켈 NTA agarose와 용해물을 4°C에서 2.5시간 동안 부드럽게 흔들어주며 함께 배양합니다.

4°C에서 400 ×g로 5분간 원심분리하여 비드를 펠렛화합니다. 이후의 모든 세척 및 용출 과정은 별도의 언급이 없는 한 동일한 원심분리 설정으로 수행합니다. 원심분리 후,

마이크로 원심분리 튜브에 상층액 30 µL와 4배 농도 SDS 샘플 버퍼 10 µL를 혼합하고, 순도 분석을 위해 얼음 위에 보관하십시오. 그런 다음 상층액의 나머지 부분을 버리고 비드를 lice 세척 버퍼로 4회 세척하십시오. 각 세척 단계 사이에 소금 버퍼로 한 번 원심분리하십시오. 이 시점부터 샘플은 항상 얼음 위에 유지해야 합니다.

SLO는 산화환원 반응에 매우 민감한 단백질이며, 짧은 시간이라도 37 °C로 가열될 경우 활성을 빠르게 상실합니다. SLO 단백질을 용출시키려면, 비드에 1 mL의 용출 버퍼와 1 M DTT 5 µL를 첨가한 후 얼음 위에서 10분 동안 배양하십시오. 그 다음 원심분리하여 용출 번호가 표시된 원심분리 튜브에 상층액을 수집하십시오.

이 과정을 세 번 반복한 다음, SLO 단백질에서 엔도톡신을 제거하기 위해 세척된 poly mixing 접합 agro bead 200 µL(res salt 버퍼에 현탁됨)를 시료에 첨가하고 4 °C에서 30분 동안 흔들어 섞습니다. 그런 다음 4 °C에서 10,000 ×g로 1분간 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 상청액을 라벨이 부착된 새 마이크로 원심분리 튜브에 수집합니다.

각 용출액 30 µL를 4배 SDS 시료 버퍼 10 µL와 혼합합니다. SDS-PAGE 분석을 위해 SLO 용액을 얼음에 보관하십시오. 단백질 농도와 용혈 활성을 측정하고, 결과가 만족스러우면 SLOE를 5~10 µL씩 분주한 후 드라이아이스에서 급속 냉동하여 -80 °C에서 보관하십시오.

그 다음 특이적 용해도를 결정합니다. 테스트할 세포를 2 x 10⁶ cells/mL 농도로 buffer RB(20 µg/mL 포함)에 부유시킵니다.

프로피듐 아이오다이드(Propidium iodide). 여기서는 T 27 A 세포를 테스트합니다. 각각의 마이크로 원심분리 튜브에 담긴 세포 100 µL를 96-well V-bottom 플레이트의 각 웰에 첨가합니다.

SLO를 버퍼 RB로 최종 농도의 2배가 되도록 단계별 희석합니다. 그 다음 독소 100 µL 또는 버퍼 RB 100 µL를 세포에 첨가하고 37 °C에서 5분 동안 배양합니다. 일반적인 최종 농도 범위는 2000 units/mL에서 31.25 units/mL까지입니다.

유세포 분석기(flow cytometer)로 세포를 분석하고 fi, cethrin 또는 pe 필터를 사용하여 데이터를 수집합니다. 1 log shift는 일시적으로 투과성이 된 세포를 나타내며, 3 log shift는 사멸된 세포를 나타냅니다. 실험군에서 대조군의 사멸 세포 백분율을 뺀 값을 통해 세포의 특이적 용해(specific lysis)를 계산합니다. 실험 하루 전, 콜라겐 코팅된 글라스에 2x10⁵ 개의 대식세포를 분주합니다.

하단 35 mm 디쉬입니다. 독소 전달에 사용되는 현미경에는 도립 스테이지, 가열 스테이지, 적절한 들뜸/방출 필터 큐브, 그리고 가능하다면 베르탕 렌즈(bertand lens)가 갖춰져 있어야 합니다. 이 과정에서 가장 어려운 부분은 니들을 손상 없이 세포까지 내려보내는 것입니다.

성공적인 실험을 위해, 일반적으로 정렬에 사용되는 Bertrand 렌즈를 사용하여 바늘이 초점 평면을 통과할 때 이를 시각화합니다. 현미경은 마이크로 인젝터에 연결되어야 하며, 데이터를 수집하고 저장하기에 충분한 메모리를 갖춘 컴퓨터로 제어되어야 합니다. 현미경과 마이크로 인젝터의 전원을 켜고, 가열 스테이지가 37 °C로 데워질 때까지 충분한 예열 시간을 갖습니다. 37 °C에서 염료를 사용하여 세포를 30분 동안 염색합니다.

분석법에 따라 라벨링은 1 mL HBSS에 포함된 5 µL, 4 µL 또는 2 µL의 calcium 또는 1 mL 완전 배지에 포함된 2 µL의 calcium으로 수행할 수 있으며, 여기서는 4 µL 또는 2 µL를 사용합니다. 세포 배지를 제거하고 PBS로 세포를 한 번 세척합니다. PBS를 흡입하여 제거하고 2 mM calcium chloride가 첨가된 1 mL RPMI로 교체합니다.

디시를 현미경 위에 장착하고, 명시야(brightfield)로 세포의 초점을 맞춘 후, 세포보다 약간 위쪽에 초점이 맺히도록 조정합니다. 다음으로, 1 µL의 SLO toxin, 4 µL의 DEXTRA 5 55(10 mg/mL), 그리고 6 µL의 물을 혼합합니다. 그런 다음 4 °C에서 10분 동안 20,000 ×g로 원심분리합니다.

Dextran은 펨토 팁(femto tip)이 막히지 않았음을 확인하는 데 사용됩니다. 마이크로 로더를 사용하여 희석된 독소 2 µL를 펨토 팁 후면에서 주입합니다. 펨토 팁을 마이크로 인젝터에 장착합니다.

그다음 인젝터의 각도를 조절하여 팁이 모든 방향으로 움직일 수 있는 여유를 둔 상태에서 세포의 중앙 위에 위치하도록 합니다. 마이크로 인젝터 팁이 내려갈 수 있는 하한선을 제한하는 이전의 Z 제한 설정을 해제하십시오. 마이크로 인젝터를 20 PSI의 배압과 함께 120 PSI에서 0.5초 동안 주입하도록 설정합니다. 그런 다음 팁을 배지에 진입할 때까지 내립니다.

Bertrand 렌즈를 사용합니다. 팁을 중앙에 맞추고, 팁이 세포에 더 가까이 내려감에 따라 팁을 계속 추적합니다. 바늘이 초점에서 벗어나면 다시 일반 광학계로 전환합니다.

시야에 바늘의 그림자가 보여야 합니다. 세포 위쪽으로 초점을 맞춘 후, 바늘이 초점에 들어올 때까지 바늘을 내립니다. 그런 다음 세포의 초점을 맞추고 바늘을 세포 근처로 조심스럽게 가져갑니다.

주입을 위한 Z 한계값을 설정한 후, 이미징을 시작하고 독소를 주입하십시오. 그다음 바늘을 들어 올려 세포의 새로운 영역으로 이동합니다. 추가로 독소를 주입하고 주입 후 이미징을 계속하십시오.

이 비디오에서 설명한 방법을 사용하여 바늘을 홈 위치로 이동시켜 바늘로부터 원치 않는 독소가 누출되는 것을 방지하십시오. 10⁷~10⁸ units/mL. SLO는 일반적으로 4 mg/mL의 단백질 농도로 얻어집니다. 이 SDS-PAGE 젤은 독소 유도 전후의 박테리아 샘플과 정제 후 세 번의 용출액을 보여주며, 쿠마시 블루 염색 결과 유도된 SLO가 성공적으로 정제되었음을 확인할 수 있습니다.

T 27 A 또는 D 두 세포의 용해에 필요한 독소 양을 결정하기 위해 69 kilodaltons 밴드에서 SLO를 측정하였습니다. 세포에 다양한 농도의 SLO를 propidium iodide 존재 하에 37 °C에서 5분 동안 처리한 후 유세포 분석기로 관찰하였습니다. 특이적 용해도는 여기에서 보여주는 바와 같이 결정되었습니다.

밀리리터당 250 unit입니다. SLO는 T 27 A 세포와 D two 세포 모두에 대해 50% 용해를 유도합니다. 독소의 세포 하부 용해(sub-litic) 10% 용해 농도는 밀리리터당 62.5 unit입니다.

이 값들은 독소 노출 후의 세포 사멸을 평가하기 위한 벤치마크 독소 활성에 중요합니다. 인간 피부 섬유아세포를 Life Technologies의 live dead 키트를 사용하여 calcium 및 atherium homodimer와 함께 배양했습니다. 세균성 독소인 anthro lysin O에 국소적으로 노출시킨 후, 이 이미지에서 calcium은 녹색으로, atherium bromide는 적색으로 표시됩니다. 마이크로바이옴에 인접한 영역은 calcium 손실과 athe homodimer 흡수로 특징지어지는 세포 사멸을 보여주는 반면, 끝단에서 멀리 떨어진 영역은 손상이 없음을 보여줍니다.

독소의 미세 전달을 통해 칼슘 플럭스와 같은 실시간 이벤트의 관찰이 가능합니다. 4:02 AM이 로딩된 이러한 인간 dcs를 일정 유속으로 SLO에 노출시키면서 녹색에서 청색으로의 변화를 실시간 이미징으로 관찰하였습니다. 의사 색상은 세포질 내 칼슘 농도의 증가를 나타냅니다.

SLO는 세포질 내 칼슘의 급격한 증가를 유도하며, 국소적 전달로 인해 디시의 해당 영역 전체로 전파됩니다. 그러나 마이크로 인젝터 팁과 가까운 세포들만이 독소에 노출되어 반응합니다. 이는 독소에 대한 개별 세포의 반응과, z-축 차원에서의 이벤트를 구분하기 위한 독소 전달의 공간적 제한 영역을 모두 보여줍니다.

마이크로 딜리버리(Micro delivery) 기술을 고속 3D 공초점 현미경법과 결합하였습니다. 이 이미지 세트는 독소 주입 후의 수지상 세포를 보여줍니다. 세포막을 표지하기 위해 녹색으로 표시된 PC가 접합된 anti CD 11 C와 함께 사전 배양되었습니다.

여기에서 볼 수 있듯이, 독소 전달 후에 마이크로베시클이 방출됩니다. 세포 복구 과정의 일부로, 독소 분자들이 블레브(blebs)에 농축되며, 이 블레브는 독소를 제거하기 위해 탈락됩니다. 숙달되면 현미경 관찰은 45분 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때, 세포와 혼합하기 전까지 독소를 차갑게 유지하고 용혈 활성을 테스트하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 좋습니다. 이 영상을 시청한 후, 라이브 셀 현미경 검사를 통해 박테리아 독소에 대한 면역 세포 반응의 실시간 역학을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다.