단일 분자 이미징을위한 소형 양자 점

이 실험 절차의 전반적인 목적은 단분자 이미징에 사용하기 위해 밝기와 안정성이 최적화되고 크기와 비특이적 결합이 최소화된 형광 양자점을 제조하는 것입니다. 이를 위해 먼저 작은 셀레늄화 카드뮴 양자점 코어를 제조합니다. 두 번째 단계는 이 코어들을 수은과 합금화하여 형광을 적색 스펙트럼으로 이동시키고 밝기를 높이는 것입니다.

다음으로, 형광 방출을 안정화하기 위해 나노 결정 위에 얇은 합금 껍질을 성장시킵니다. 마지막 단계는 생물학적으로 불활성인 폴리에틸렌 글리콜로 수식할 수 있는 다좌 폴리머를 사용하여 이러한 입자들을 유기 용매에서 수성 완충액으로 옮기는 것입니다. 최종적으로 형광 분광법, 겔 크로마토그래피 및 겔 전기영동을 통해 이 입자들이 밝은 형광, 조밀한 수력학적 크기, 그리고 중성 정전하 특성을 가지고 있어 생물학적 단일 분자 형광 이미징에 매우 적합함을 보여줍니다.

기존의 상용 재료와 비교했을 때 이러한 양자점의 주요 장점은 나노입자의 유체역학적 크기가 현저히 감소했다는 점입니다. 양자점의 크기가 작아지면 형광 강도와 형광 안정성이 저하되고 청색 스펙트럼에서만 형광이 나타나는 부정적인 영향이 있지만, 본 연구에서는 수은 양이온 교환 공정을 통해 이러한 효과를 상쇄했습니다. 이러한 나노 결정은 혼잡한 생물학적 환경에서 단일 생체 분자의 동적 이미징을 가능하게 함으로써 생물물리학 및 세포 신호 전달의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다.

먼저, 50 mL 3구 플라스크에 셀레늄을 넣고, 고진공 상태에서 플라스크 내부를 배기한 후 공기 차단 조건에서 슐렌크 라인(Schlenk line)을 사용하여 아르곤으로 충전함으로써 0.4 M 셀레늄 TOP 용액을 준비합니다. TOP 10 mL를 첨가하고 1시간 동안 교반하며 100 °C로 가열하여 투명하고 무색인 용액을 얻습니다.

용액을 실온으로 식힌 후 플라스크를 그대로 둡니다. 또한, 서면 프로토콜에 기재된 양을 사용하여 250 mL 3구 플라스크에 산화 카드뮴, TDPA 및 ODE 용액을 준비합니다. 이 영상과 함께, 교반하면서 샨크 라인(shank line)을 사용하여 용액을 진공 배기합니다.

온도를 100 °C까지 올리고 15분 동안 추가로 진공 배기합니다. 아르곤 가스 하에서 저비점 불순물을 제거하기 위해, 혼합물을 300 °C로 1시간 동안 가열하여 산화 카드뮴을 완전히 용해시킵니다. 용액의 색이 붉은색에서 투명하고 무색으로 변하면 용액을 실온까지 냉각합니다.

다음으로, 카드뮴 용액에 HDA를 첨가하고 70 °C로 가열한 후 진공 배기합니다. 압력이 일정하게 유지되면 온도를 높여 용액을 30분 동안 환류시킵니다. 슐링크 라인 밸브를 불활성 가스로 전환하고 열전대를 용액에 직접 삽입합니다.

공기 차단 조건 하에서, 카드뮴 용액에 DPP를 첨가하고 온도를 310 °C까지 올립니다. 이제 16게이지 바늘이 장착된 일회용 플라스틱 주사기를 사용하여 0.4 M 상층 셀레늄 용액 7.5 mL를 취합니다. 온도가 310 °C로 평형을 이루면, 온도 조절기를 0 °C로 설정하고 상층 셀레늄 용액을 카드뮴 용액에 빠르게 직접 주입합니다.

용액은 무색에서 노란색, 주황색으로 변하며, 온도는 빠르게 떨어졌다가 다시 약 280 °C까지 상승합니다. 이 절차에서 가장 어려운 단계는 시린지의 전체 부피를 카드뮴 용액에 가능한 한 빠르게 주입하는 것입니다. 이는 입자들이 균일하게 핵형성 되도록 하기 위함입니다.

1분간 반응시킨 후, 플라스크를 가열 맨틀에서 제거하고 공기 흐름으로 빠르게 냉각하여 온도를 200 °C 미만으로 낮춥니다. 온도가 약 40 °C에 도달하면 30 mL의 hexane으로 희석하며, 이때 남은 카드뮴 전구체의 대부분이 용액에서 침전됩니다. 원심분리를 통해 이 침전물을 제거합니다.

6개의 50 milliliter 폴리프로필렌 원추형 원심분리 튜브 각각에 얻어진 조 nano Krystal 용액 12 milliliters를 희석합니다. 동일한 매개변수로 원심분리한 후, 40 milliliters의 아세톤을 사용하여 상층액을 조심스럽게 따라내어 버립니다. 다음으로, nano krysttal 펠렛을 헥산에 녹입니다.

동일한 부피의 메탄올로 용액을 추출하여 상층을 회수합니다. 이 추출 과정을 두 번 더 반복하여 총 3회 추출합니다. 메탄올의 부피를 약 15 milliliters로 조정하면 약 200 micromolar 농도의 순수한 카드뮴 셀레나이드 양자점 농축 헥산 용액을 얻을 수 있습니다.

이 반응의 일반적인 수율은 직경이 2~3 nm인 3 µM 농도의 셀렌화 카드뮴 결정입니다. 서면 절차에 설명된 대로 자외선-가시광선 흡수 스펙트럼을 측정하여 나노 결정의 직경과 농도를 결정하십시오. 나노 결정의 일부를 수은으로 교환하여 흡수 및 형광 방출 파장을 적색 편이시킬 수 있습니다. 이를 위해 교반 바가 들어 있는 20 mL 유리 바이알에 헥산과 클로로포름을 혼합한 후, 셀렌화 카드뮴 양자점 OLA 용액과 옥탄올 수은 화합물을 첨가하십시오. 서면 절차에 설명된 대로 나노 결정을 정제하고 농도를 결정한 후, 쉘 성장을 위해 나노 결정을 실온에서 최소 24시간 동안 숙성시키십시오.

50 mL 3구 플라스크에 0.1 M 쉘 전구체 용액을 준비합니다. 진공 상태에서 카드뮴 전구체, 아연 전구체 및 황 전구체 용액을 1시간 동안 환류 가열하여 투명한 용액을 얻은 다음, 아르곤 가스로 충전된 3구 플라스크에 넣습니다. TOPO ODE와 준비된 머큐리 카드뮴 셀레나이드 양자점을 첨가합니다. 플래스크 라인을 사용하여 실온에서 헥신을 진공 제거합니다.

온도를 100 °C로 올리고 15분 동안 환류시킵니다. 라인 밸브를 아르곤 가스로 변경하고 나노 크리스탈 용액에 열전대를 삽입합니다. 온도를 120 °C로 올린 후, 황 전구체 용액 0.5 단분자층 또는 140 µL를 첨가하고 15분 동안 반응시킵니다.

온도를 140 °C까지 올립니다. 0.5 단분자층 또는 140 µL의 카드뮴 전구체 용액을 첨가하고 15분 동안 반응시킵니다. 그 후 반응 용액에 500 µL의 무수 OLA를 첨가합니다.

160 °C에서 황 전구체 용액 0.5 단층 또는 220 µL를 첨가한 후, 170 °C에서 동일한 양의 아연 전구체 용액을 첨가하며 각 첨가 단계 사이에 15분의 간격을 둡니다. 그 다음 180 °C에서 15분 간격으로 황 전구체 용액과 아연 전구체 용액을 각각 0.25 단층 또는 150 µL씩 첨가합니다. 용액을 실온으로 냉각하고 이 입자들에 대한 새로운 소멸 계수를 측정합니다.

UV-vis 스펙트럼을 사용하여 나노 결정의 수가 변하지 않았다고 가정하고, 반응 용액을 조혼합물 상태로 냉동고에 보관하십시오. 이 단계에서 나노 결정은 전자 현미경, UV-vis 흡수 분광법 및 형광 분광법을 사용하여 특성을 분석할 수 있습니다. 정제된 코어-쉘 양자점을 50 milliliter 3구 플라스크에 넣고 고진공 상태에서 헥산을 제거하십시오.

건조 필름을 얻으려면 플라스크를 argonne으로 채웁니다. 나노입자 필름에 무수 purine을 첨가하고 1~2시간에 걸쳐 슬러리를 80 °C까지 가열합니다. 그러면 나노입자가 완전히 용해됩니다.

용액에 1 M FIO 글리세롤 1 mL를 첨가하고 80 °C에서 2시간 동안 교반합니다. 용액을 실온으로 식힌 후, 티오글리세롤을 탈양성자화하기 위해 트리에틸아민 0.5 mL를 첨가하고 30분 동안 교반합니다. 이 용매 혼합물에서 극성 나노 결정의 용해도가 낮기 때문에 트리에틸아민 첨가 후 용액이 탁해질 수 있습니다.

양자점 용액을 20 mL의 헥산과 20 mL의 아세톤 혼합액이 담긴 50 mL 원추형 원심분리 튜브로 옮기고 잘 혼합합니다. 원심분리를 통해 침전된 나노 결정체를 분리한 후, 아세톤으로 펠릿을 세척하고, 배스 초음파 처리를 통해 양자점 펠릿을 5 mL의 DMSO에 용해시킨 뒤 다시 원심분리를 수행합니다. 응집물을 제거한 후, UV-Vis 흡수 스펙트럼을 통해 나노입자 농도를 결정합니다.

순수 양자점 용액의 표면은 공기 중의 주변 환경 조건에서 서서히 산화될 수 있으므로 3시간 이내에 사용해야 합니다. DMSO를 이용해 양자점 용액을 10 µM 이하로 희석하여 50 mL 플라스크로 옮깁니다. 교반하면서 DMSO에 희석된 5 mg/mL의 폴리아크릴산 용액을 양자점 용액에 한 방울씩 첨가하고, 실온에서 5분 동안 용액의 가스를 제거합니다.

퀀텀닷 폴리머 용액을 아르곤으로 퍼지하고 80 °C에서 90분 동안 가열합니다. 용액을 실온으로 냉각한 후, pH 8의 50 mM 아세트산 나트륨을 동일한 부피로 한 방울씩 첨가하고 10분 동안 교반합니다. 서술된 절차에 따라 퀀텀닷을 정제하고 UV-vis 흡수 스펙트럼을 통해 농도를 결정합니다. 교반자가 들어있는 4 mL 유리 바이알에 750 Dalton 모노아미노 폴리에틸렌 글리콜을 40,000배 몰 과량으로 첨가하여 붕산염 완충액 내의 퀀텀닷 1몰과 혼합합니다.

나노 결정에 특정 화학적 기능을 부여하는 방법에 대한 지침은 서면 절차서에서 확인할 수 있습니다. 갓 준비한 활성화제 용액을 양자점 용액에 몰 농도 기준 25,000배 과량으로 빠르게 첨가하고 실온에서 30분 동안 교반하십시오. 나노 결정 표면을 PEG로 포화시키기 위해 이 단계를 4회 더 반복하십시오.

마지막으로, 반응을 정지시키기 위해 1 M tris 완충액 200 µL를 첨가한 후, 투석 원심 여과 필터 또는 초원심분리를 사용하여 나노 결정(nano crystals)을 정제합니다. 생성된 나노 결정의 단분산성, 유체역학적 크기 및 표면 전하는 액체 크로마토그래피, 겔 전기영동 및 형광 현미경을 사용하여 분석할 수 있습니다. 여기에는 카드뮴 셀레나이드(cadmium selenide) 나노 결정, 양이온 교환 후의 수은 카드뮴 셀레나이드 나노 결정, 그리고 껍질 성장 후의 코어 수은 카드뮴 셀레나이드-껍질 카드뮴 아연 황화물 나노 결정에 대한 대표적인 흡수 및 형광 스펙트럼이 나타나 있습니다. 코어 카드뮴 셀레나이드 나노 결정의 형광 양자 수율은 약 15%입니다. 하지만 수은 교환 후에는 이 효율이 1% 미만으로 떨어지는데, 이는 표면 원자의 교란으로 인해 도입된 전하 운반체 트랩(charge carrier traps) 때문인 것으로 보입니다.

카드뮴 아연 황화물의 얇은 쉘을 성장시키면 이 효율을 70% 이상으로 높일 수 있으며, 이는 수중으로 전이한 후에도 대부분 유지됩니다. 반면, 수은이 포함되지 않은 카드뮴 셀레나이드 코어 및 카드뮴 아연 황화물 쉘 나노 결정은 두꺼운 쉘을 성장시키지 않는 한 수중에서 양자 수율의 상당 부분을 상실합니다. 카드뮴 아연 황화물로 캡핑하면 전자 전하 운반체가 쉘 물질로 누출되어 스펙트럼이 적색 편이된다는 점에 유의해야 합니다.

이러한 이동은 카드뮴 코어의 경우 약 20에서 30 nanometers이며, 코어 내 수은 함량이 증가함에 따라 함께 증가합니다. 따라서 코어 나노 결정에 수은을 통합함으로써, 밝기를 희생하지 않고도 나노 결정의 작은 크기를 유지할 수 있습니다. 작은 크기는 이 투과 전자 현미경 사진과 평균 직경이 3.2 ± 0.6 nanometers인 코어 HgCdSe/쉘 CdZnS 나노 결정의 입자 크기 분포에서 확인할 수 있습니다.

수용액으로의 2단계 상전이 과정을 이용하는 것은 응집체와 집합체를 제거하기 위한 추가적인 크기 배제 크로마토그래피 기반의 크기 분류가 필요 없는 균일한 나노 결정 집단으로 얻는 데 매우 중요합니다. 여기에 표시된 크로마토그램은 크기가 con albumin의 크기와 유사함을 확인시켜 줍니다. 75 kilodaltons의 크기에서 750 Dalton amino PEG로 수식한 후, 크기는 IgG 항체와 유사한 12 nanometers로 증가합니다.

여기 묘사된 아가로스 겔 전기영동 실험에서 확인된 바와 같이, PEG 수식은 표면 전하를 중성으로 만듭니다. 화살표로 표시된 웰과 오른쪽에 표시된 전극 극성을 통해, 접합 전의 나노 결정은 이온성 입자로 이동하며 PEG화된 나노 결정은 정전기적으로 중성임을 알 수 있습니다. 여기에는 유리 커버슬립 위에 증착되어 545 nanometer 가시광선으로 여기시킨 나노 결정의 에피 형광 현미경 사진이 나와 있습니다. 이러한 나노 결정은 전자 증배 CCD 카메라를 사용하여 초당 30 프레임의 속도로 단일 분자 수준에서 쉽게 관찰됩니다.

이 그래프는 연속적인 여기 상태에서 각 프레임에 관찰되는 형광 입자의 수가 시간이 지남에 따라 변동함을 보여줍니다. 이는 블링킹(blinking)과 광분해(photo degradation)가 결합되어 나타나는 현상입니다. 처음 7분 동안은 블링킹이 지배적으로 나타나며, 이후 산화적 광분해가 서서히 뚜렷해집니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 양자점을 화학적으로 합성하는 방법, 이를 수성 완충액으로 전이시키는 방법, 그리고 바이오이미징 응용을 위해 양자점을 표면 개질하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 카드뮴과 수은을 포함하는 시약을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 개인 노출을 방지하기 위해 각별한 주의를 기울여야 함을 잊지 마십시오.