절연 Cardiomyocytes의 세포 기능에 대한 항체 효과 측정

다음 실험의 전반적인 목표는 확장성 심근병증 또는 자가면역 배경을 가진 기타 심장 질환 환자의 혈장 내 심장 친화성 항체를 검출하는 것입니다. 이는 두 번째 단계인 면역글로불린 G 정제를 위해, 항 IgG spheros 컬럼을 이용하여 환자 혈장을 1차 미니 면역 흡착함으로써 달성됩니다. 본 바이오어세이의 세포 기반을 제공하기 위해 성체 Wistar 쥐로부터 심실 심근세포를 분리합니다.

다음으로, 심근세포가 챔버 커버슬립에 부착되도록 한 뒤 URA 2:00 AM으로 염색하여 수축 중 세포 내 칼슘 과도 현상을 관찰할 수 있게 하고, 환자의 IgG를 테스트하여 심근세포 수축력에 미치는 영향을 관찰합니다. 그 결과는 분리된 심근세포의 수축력 및 칼슘 과도 현상의 변화를 바탕으로 환자의 IgG에 친화성 항체가 포함되어 있는지 여부를 입증합니다. 항체 검출을 위한 표준 면역 분석법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 특정 항원에 의존하지 않으며, 자극 항체와 차단 항체를 구별할 수 있다는 점입니다.

이 절차의 시연은 Google 및 저희 실험실의 기술 지원을 통해 진행됩니다. 이 절차를 시작하려면, 빈 econopak 컬럼에 2 mL의 환자 EDTA 혈장당 3 mL의 anti IgG spheros를 채워 미니 면역 흡착 컬럼을 준비하십시오. 그다음, anti IgG spheros 위에 필터를 배치하십시오.

컬럼의 하단 팁을 절개하고 필터를 눌러 초당 약 한 방울의 유속이 되도록 조절합니다. 그런 다음 0.9% Sodium chloride 1플라스마 부피로 컬럼을 세 번 세척합니다. 플라스마가 anti IgG Spheros에 완전히 침전되면, 동일한 부피의 0.9% sodium chloride로 컬럼 내의 플라스마를 피펫팅하여 세척합니다. 다음으로 pH 2.8의 0.2 molar glycine hydrochloride 1플라스마 부피를 컬럼에 피펫팅하고 구슬(spheres)에 침전되도록 둡니다.

그 다음 글리신 염산염을 컬럼에 동일한 부피만큼 추가합니다. 유출액을 15 milliliter 튜브에 수집하고, pH 8.0의 0.5 molar tris 염산염을 사용하여 pH를 7.3으로 조절함으로써 컬럼을 재생합니다. 0.9% sodium chloride를 두 부피만큼 사용하여 최종 세척한 후, 글리신 염산염을 플라스마 부피의 3배만큼 사용하여 세척합니다.

해당 컬럼은 심근세포용 다음 혈장 샘플에 다시 사용할 수 있습니다. 수집된 IgG 분획은 먼저 분자량 컷오프가 100 kilodaltons인 셀룰로오스 에스테르 투석막 튜브에 IgG 분획을 채운 후, 실험 버퍼(experimental buffer)에 대해 투석해야 합니다. 그 다음 튜브를 1 liter EB에 넣고 4 °C에서 마그네틱 스터러로 천천히 교반합니다. 8시간 후, 투석 튜브를 3 liters의 신선한 EB로 옮겨 4 °C에서 20시간 동안 추가로 투석합니다.

시료를 항온수조에서 57 °C로 30분 동안 가열합니다. 보체 인자를 비활성화하기 위해, 총 IgG 농도를 측정하고 각각 330 µg의 IgG를 포함하는 분주액을 준비합니다. 본 과정에서는 동봉된 원고에 따라 칼슘이 없는 분리 버퍼를 준비합니다.

그다음 thermostat lanor perfusion system의 상단 저장조에 IB 80 milliliters를 채우고, 버퍼를 37 °C로 유지하며 95% oxygen, 5% carbon dioxide로 30분 동안 에어레이션합니다. collagenase type two 약 7,000~10,000 units와 fatty acid-free BSA 174 milligrams를 112.5 µM calcium chloride가 포함된 IB 20 milliliters에 녹인 후, 필요에 따라 상단 저장조 내 분리 버퍼의 pH를 조절합니다.

다음으로, thiopental 용액에 2,500 IU heparin을 첨가하여 kg당 375 µg의 thiopental을 사용하여 175~200g의 wistar rat을 마취합니다. 흉곽 절개 후, 대동맥궁이 온전한 상태로 심장을 조심스럽게 적출하여 얼음처럼 차가운 0% sodium chloride 용액으로 옮깁니다. 심장에서 혈액과 주변 조직을 제거합니다.

그 다음, 이를 신선한 0.9% sodium chloride로 옮기고 대동맥을 노출시킵니다. Langendorff 시스템의 유량 조절기를 켜서 초당 2~3방울의 적하 속도를 얻습니다. 그 후 심장을 캐뉼라에 연결합니다.

남아 있는 혈액을 씻어내기 위해 초당 한 방울의 유속으로 최대 3분 동안 관류합니다. 그 후, LOR 시스템에서 IB를 순환시킵니다. 이제 상단 저장조에서 버퍼 20 milliliters를 제거합니다.

리저버에 콜라게나제 용액을 채우고, 총 부피가 80 milliliters가 되도록 필요한 만큼 버퍼를 추가로 채웁니다. 그런 다음 소화 용액을 27분 동안 더 순환시킵니다. 이어서 캐뉼라에서 심장을 분리합니다.

심방과 대동맥을 제거한 후, 심실을 작은 조각으로 다집니다. 소화 완충액이 하단 저장조로 흘러 들어가게 합니다. 부피를 최대 40 milliliters로 줄여, 95%oxygen, 5%carbon dioxide를 지속적으로 공급하며 다진 심실을 10분에서 15분 동안 추가로 소화시킵니다.

그 후, 세포 현탁액을 200 micron 메쉬 크기의 거즈로 걸러 50 milliliter 튜브에 담습니다. 마지막으로, 세포 현탁액을 40 3G에서 2분 동안 원심분리하여 세포의 칼슘 함량을 복원합니다. 실온에서 세포를 10 milliliters로 재현탁합니다.

200 µM calcium chloride가 포함된 IB를 다시 원심분리하고 세포를 10 mL에 재현탁합니다. 500 µM calcium chloride가 포함된 IB를 처리합니다. 최종 원심분리 후, 심근세포를 멸균 여과된 EB에 50,000 cells/mL 밀도로 재현탁합니다.

4-웰 챔버의 커버 글라스를 웰당 10 µg의 laminin으로 코팅하고 완전히 건조될 때까지 기다립니다. 그런 다음 각 웰에 심근세포 현탁액 1 mL를 채웁니다. 팁을 자른 마이크로 파이펫을 사용하여 세포가 상온에서 1시간 동안 부착되도록 합니다. 1 mg/mL fira 2:00 AM 스톡 솔루션 10 µL를 5 mL의 eb에 희석하고, 염색 용액을 암소에 보관합니다.

다음으로, 커버 글라스에서 완충액과 부착되지 않은 세포를 제거하고 염색액 0.5 milliliters를 피펫으로 분주합니다. 각 웰에서 세포를 중간 속도로 흔들어주며 10분 동안 배양합니다. 이후, 염색액을 제거하고 1 milliliter의 eb로 세포를 한 번 세척합니다.

그런 다음, 이 절차에 따라 각 웰에 0.5 milliliters EB를 추가하고, 커버 글라스를 심근세포 칼슘 및 수축력 기록 시스템에 연결된 도립 형광 현미경 아래에 놓습니다. 유입 및 유출 튜브가 있는 맞춤 제작 전극을 첫 번째 웰에 배치하고, 분당 1 milliliter의 eb로 심근세포를 관류합니다.

20 V, 1 Hz, 펄스당 5 ms의 조건으로 전기 자극을 시작하고, 세포가 자극에 적응하도록 약 2분간 둡니다. 뚜렷한 가로무늬와 일정한 수축을 보이는 온전한 막대 모양의 심근세포를 선택하여 시야 중심에 위치시킵니다. 그런 다음 카메라 채널을 열고, 세포 프레임 어댑터를 회전시키고 현미경 스테이지를 이동하여 비디오 영역 내에서 세포가 수평이 되도록 방향을 맞춥니다.

비디오 영역의 검출 제어 요소 경계를 조정합니다. 형광 채널을 켜고 10~15회의 수축을 기록하여 초기 세포 단축 및 칼슘 과도 현상을 얻습니다. 그 후, 형광 염색제의 퇴색을 방지하기 위해 현미경 광원 채널을 끕니다.

3방향 밸브를 사용하여 흐름을 EB에서 샘플 바이패스로 전환하고, 환자의 IgG 1 mL로 심근세포를 관류합니다. 공기가 웰에 도달하기 직전에 펌프를 멈춘 뒤, 광채널을 켜고 10~15회의 수축을 추가로 기록하여 급성 세포 반응을 얻습니다. 그런 다음 기록을 일시 중지하고 광채널을 다시 끈 후, 2분 및 5분 뒤에 기록을 반복하고 완료되면 웰에서 전극을 제거합니다. 마지막으로, IonWizard 소프트웨어의 edge length/length 및 URA two numeric subtracted/ratio 윈도우를 각각 사용하여 세포 단축과 칼슘 트랜지언트를 분석합니다.

다음으로, 초기 세포 단축 및 칼슘 과도 현상 정점 높이로부터 급성, 2분 및 5분 반응의 백분율 변화를 계산합니다. 다음은 대조군 측정의 대표적인 예시입니다. 세포 단축 및 칼슘 과도 현상을 IgG 과류 주입 전, 그리고 IgG 과류 주입 직후 2분 및 5분 시점에 온라인으로 모니터링하였습니다.

다음은 심장 억제 항체를 포함하는 IgG 샘플의 측정 예시입니다. IgG 관류 전, 그리고 IgG 관류 직후 2분 및 5분 후에 세포 단축과 칼슘 과도 현상을 온라인으로 측정하였습니다. 이 영상을 시청하신 후에는, 분리된 성인 쥐 심근세포의 세포 단축 및 칼슘 과도 현상에 미치는 분리된 IgG의 영향을 측정하여 환자 혈장 내 심장 독성 항체를 검출하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.