Axons, 수석 및 뇌 슬라이스의 개별 뉴런의 수지상 쪽의 전압에 민감한 염료 기록

설명된 실험의 전반적인 목표는 단일 신경세포의 여러 부위에서 서브 마이크로미터 및 서브 밀리초 해상도로 막전위 신호 통합과 정보 처리를 광학적으로 모니터링하는 것입니다. 이는 먼저 막전위 과도 상태에 해당하는 빛 강도의 작은 분율 변화를 기록할 수 있도록 적절한 감도를 갖춘 이미징 설정을 구축함으로써 달성됩니다. 다음으로, 슬라이스 표면에 가까운 단일 초점 평면에서 길고 손상되지 않은 돌기를 가진 신경세포를 효과적으로 이미징할 수 있도록 적절한 구조를 가진 신경세포를 선택합니다.

그 다음, 막 전위 변화를 광학적으로 추적할 수 있도록 미리 선택한 뉴런에 전압 민감성 염료를 로딩합니다. 결과는 축삭, 수지상 돌기 및 수지상 돌기 가시로부터 막 전위 신호를 모니터링함으로써 개별 신경 세포의 전기적 신호 통합에 관한 정보를 얻을 수 있는 이 접근 방식의 독특한 능력을 보여줍니다. 세포 신경생리학 분야에서.

전극 측정의 낮은 공간 해상도와 축삭 측지(axon collaterals) 또는 수지상 돌기 가시(dendritic spines)와 같은 작은 구조물로부터의 기록 불가능성이라는 기존 전기생리학의 두 가지 오랜 한계로 인해 새로운 도구들이 개발되고 있습니다. 이러한 단점들을 극복하기 위해, 패치 전극 접근법을 뉴런의 모든 부분에서 병렬 기록을 가능하게 하는 광학 기술과 결합할 수 있습니다. 본 연구에서는 단일 가시 해상도로 막 전위 과도 현상을 다중 측면 광학 기록하는 이러한 기술에 대해 설명합니다.

본 실험에서는 정립 현미경과 3대의 카메라를 사용하여 균일한 조명을 조정합니다. 먼저, 레이저 빔 경로에 적절한 중성 밀도 필터를 삽입합니다. 그다음, 표준 형광 슬라이드의 표면에 대물렌즈의 초점을 맞춥니다.

모니터 화면에서 시야의 CCD 이미지를 관찰하면서, 시야의 중심이 맞고 균일한 조명이 이루어지도록 에피 형광 콘덴서의 적절한 액추에이터를 사용하여 쿼츠 광가이드 수신단과 광가이드 출력단의 위치를 조정하십시오. 진동 노이즈를 측정하려면 표면에 비형광 마크가 있는 표준 형광 슬라이드를 사용하십시오. 뉴로 CCD의 연속 모드를 사용하여 빛의 세기를 기록하십시오.

대물렌즈의 초점을 검은 표식의 어두운 가장자리에 맞추고, 2 kHz의 프레임 속도로 약 100 ms 동안 빛의 세기를 기록합니다. 그런 다음, 균일하게 조명된 영역에서 빛을 받는 약 20개 픽셀과 검은 표식의 가장자리를 따라 있는 약 20개 픽셀에서 얻은 분수 빛 세기 트레이스의 공간 평균을 표시합니다. 고대비 가장자리 픽셀의 공간 평균에서 나타나는 과잉 노이즈는 시스템의 진동 노이즈를 반영합니다.

셔터가 열릴 때 광학 기록에 진동 노이즈가 유입되지 않도록 기계식 셔터를 진동 격리 테이블 외부에 설치하는 것이 필수적입니다. 이는 매우 중요한 단계입니다. 광학 기록 시스템에 포착될 수 있는 음향 진동 노이즈를 줄이기 위해 플라스틱 나사와 진동 격리 재료를 사용하여 셔터를 설치하십시오.

진동을 격리하기 위해, 이미지의 날카로운 경계(sharp edge)를 포함하는 픽셀의 진동 노이즈가 샷 노이즈(shot noise)보다 작아질 때까지 진동 격리 테이블을 조정하십시오. 기계적 진동이 현미경 본체로 전달되는 것을 방지하려면 테이블 위의 장비 배선이 느슨하게 유지되어야 합니다. 이 절차에서는 스피닝 디스크 공초점 시스템을 사용하여, 관심 있는 개별 신경 세포에서 EGFP를 발현하는 마우스 라인으로 표준 절차에 따라 300 to 400 micron 두께의 뇌 절편을 준비하십시오.

슬라이스 내의 EGFP 표지 뉴런을 시각화합니다. 다음으로, 막전위 이미징을 위해 수지상 돌기 및 축삭 나무 구조가 온전하고, 돌기가 슬라이스 표면과 평행하게 가깝게 뻗어 있는 뉴런을 선택합니다. 그런 다음, 약 15초 동안 음압을 가하여 유리 패치 피펫의 팁부터 전극 테이퍼의 3분의 2 지점까지 염료가 없는 세포 내 용액으로 채웁니다.

그 후, 세포 내액에 용해된 막 IMP 투과 전압 민감성 염료가 포함된 용액으로 전극을 다시 채웁니다. 염료를 전극에 채운 후 1분 이내에 이전에 선택한 뉴런을 패치합니다. 피펫을 배스(bath)에 내리기 전, 약 10 mmHg의 낮은 양압을 가하고 슬라이스 내에 전극을 배치하는 동안 이 압력을 유지하여, 씰(seal)이 형성되기 전까지 전극에서 염료가 유출되지 않도록 합니다.

전극이 세포 표면에 접촉하기 직전에 압력을 수은주 100 millimeters of mercury 정도의 고압으로 높입니다. whole cell 구성으로 씰(seal)을 형성한 후, somatic patch pipette에서 세포체(soma)로 염료가 자유롭게 확산되도록 20분에서 45분 동안 둡니다. 염료 확산 과정 동안 current clamp 모드에서 유발 활동 전위를 기록하여 뉴런의 생리적 상태를 모니터링합니다.

또한, 뉴트럴 밀도 필터(neutral density filters)로 조정한 전체 광강도의 일부 수준에서 2kHz의 프레임 속도로 세포체(cell soma)의 정지 광강도를 기록하여 염색량을 모니터링하십시오. 활동 전위(action potential)가 넓어지기 시작할 때까지 다운로딩 과정을 계속하십시오. 염색이 끝나면 전압 클램프(voltage clamp) 설정 상태에서 패치 피펫을 세포체로부터 조심스럽게 당겨, 전체 세포(whole cell) 설정에서 외부-외부 패치(outside-out patch) 설정으로의 전환이 이루어지도록 하십시오.

그 후, 전압 민감성 염료가 신경 돌기까지 퍼질 수 있도록 슬라이스를 실온에서 1.5~2시간 동안 추가로 배양합니다. 상당량의 염료가 세포체에서 수지상 돌기 및 축삭 돌기로 확산되면, 활동 전위의 파형이 완전히 복구되어야 합니다. 다음 단계에서는 저강도 형광 하에서 염색된 뉴런의 세포체를 찾습니다.

중성 밀도 필터를 사용하여 빛의 세기를 XY 스테이지를 통해 관찰 대상물을 시각화하는 데 필요한 최소 수준으로 줄입니다. 형광 뉴런이 포함된 절편 영역을 스캔하여 형광 소마를 찾습니다. 염색된 세포의 소마를 현미경 시야의 중앙에 위치시키고, DIC 모드에서 염료가 없는 표준 패치 전극으로 뉴런을 패치합니다. 그런 다음, 전압 이미징을 위해 CCD의 연속 기록 모드에서 10~40 Hz의 프레임 속도로 저강도 형광 하에 뉴런 돌기를 시각화합니다.

XY 스테이지 위치를 조정하여 촬영 영역 중앙에 관심 있는 신경세포 돌기를 배치합니다. 또한, 광역학적 손상을 줄이기 위해 현미경의 필드 스톱 조리개를 부분적으로 닫아 SOMA를 여기광으로부터 보호합니다. 다음으로, 개별 수지상 돌기 분지에서 역전파 활동 전위와 관련된 광학 신호를 기록합니다.

그런 다음 축삭의 활동 전위와 관련된 광학 신호를 기록합니다. 그 후, 수지상 돌기 가시의 역전파 활동 전위와 관련된 광학 신호를 기록합니다. 신호 파형을 정확하게 재구성하기 위해 적절한 프레임 속도를 사용하십시오.

동시에, 염료 표백과 광동역학적 손상을 최소화하기 위해 기록 기간과 고강도 들뜸 빛에 노출되는 시간을 최대한 짧게 유지하십시오. 여기에서 광학 신호의 기록 과정이 제시됩니다. 상단 패널은 기록 위치에 있는 축삭을 포함하여 염색된 뉴런의 고해상도 공초점 이미지를 보여줍니다.

중앙 패널은 막전위 이미징에 사용된 CCD로 획득한 축삭의 저해상도 형광 이미지를 보여주며, 하단 패널은 soma의 전극 기록과 A IS 및 rvi 결절의 광학 기록을 나타냅니다. 가공되지 않은 원시 데이터와 처리된 신호가 함께 표시되어 있습니다. 이 그림은 전압 민감성 염료가 로딩된 L5 피질 뉴런 축삭의 활동 전위 신호를 보여줍니다.

잠재적인 관련 신호들을 10 kilohertz의 프레임 속도로 기록하였습니다. 이 트레이스들은 세 지점에서의 활동 전위 일시 변화를 나타냅니다. 첫 번째는 세포체에서 기록한 전극입니다.

둘째는 축삭둔덕(axon hillock)의 광학 기록이며, 셋째는 첫 번째 마디(node of Ranvier)의 광학 기록입니다. 그리고 여기 동일한 세 지점에서 얻은 중첩 신호가 있습니다. 이 그림은 100 Hz의 짧은 탈분극 전류 펄스에 의해 유도된 L5 피질 뉴런 수지상 돌기 분지상의 여러 지점에서 발생하는 4회의 역전파 활동 전위 신호 버스트를 보여줍니다. 여기에는 개별 수지상 돌기 가시(dendritic spine)에서 측정된 활동 전위 신호가 나타나 있습니다.

여기에 스피닝 디스크 공초점 이미지 스택으로 얻은 해부학적 재구성 이미지가 있으며, 여기에는 CCD 카메라로 촬영한 동일 영역의 형광 이미지가 있습니다. 막전위 이미징을 위해, CCD 이미지에 표시된 1번부터 3번 위치에서 발생하는 역방향 전파 활동 전위에 해당하는 형광 강도 추적선이 오른쪽 패널에 표시되어 있습니다. 하단 추적선은 세포체에서 기록된 전극 신호를 나타냅니다.

사전 기록 준비에는 주사위 모양의 세포(dice)가 원위 돌기(distal processes)까지 퍼지는 대기 시간을 포함하여 약 3시간이 소요됩니다. 기록 시간은 준비물의 일반적인 기능 저하(rundown) 및 PO 광역학적 손상에 의해 제한됩니다. 광역학적 손상의 정도는 들뜸 빛(excitation light)의 강도, 그리고 개별 기록 시도의 지속 시간 및 횟수에 비례합니다.

일부 실험에서는 1~2시간 동안 50회 이상의 기록 시험을 수행하는 것이 가능합니다. 반면, 다른 측정법들은 높은 여기 상태, 강한 빛의 세기 및 더 긴 기록 시간을 필요로 하며, 광역학적 손상으로 인해 기록 시험 횟수가 몇 차례로 제한됩니다. 이 영상을 시청하고 나면, 뇌 절편 내 개별 뉴런의 전체 축삭 및 말단 구조에서 전압 이미징을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.