동시 Electroencephalography, 설치류 대뇌 피질의 젖산 농도와 Neuronal 활동 Optogenetic 조작의 실시간 측정

이 절차의 전반적인 목적은 정밀한 정위 좌표에서 광유전학적 자극을 주는 동안 EEG로 정의된 수면 상태와 젖산 농도를 측정하는 것입니다. 뇌전도 리드선과 젖산 센서 및 광섬유 케이블을 위한 캐뉼라를 외과적으로 이식하십시오. 그 다음, 동물의 두개골에 설치된 가이드 캐뉼라 내로 광섬유 케이블과 사전 보정된 젖산 센서를 삽입하십시오.

다음으로, 원하는 전기생리학적 반응을 얻기 위해 청색광 자극 강도를 조절합니다. 그 후, 동물이 자발적으로 행동하거나 수면을 취하는 동안 뇌파, 근전도 및 젖산 농도 데이터를 수집합니다. EEG의 약리학적 연구와 같은 다른 방법들과 비교했을 때, 이 실험적 접근법은 뉴런의 활동을 1초 미만의 시간 단위로 실시간 조작하면서 뇌의 생화학 및 전기생리학적 상태를 모니터링할 수 있다는 장점이 있습니다.

따라서 수면 연구 분야에서 새로운 통찰력을 제공할 가능성이 매우 높습니다. 예를 들어, 서파 수면의 대사 및 전기생리학적 수반 현상을 식별할 수 있습니다. 이러한 유형의 실험은 학습 및 기억, 시냅스 가소성 또는 발작성 질환과 같은 신경과학의 다른 분야에도 적용될 수 있습니다.

해당 수술 기법은 기술적으로 매우 까다롭습니다. 상당한 숙련도가 필요하지만, 이는 충분한 연습을 통해 습득할 수 있습니다. 본 시각적 시연에서는 서면 설명의 보완을 위해 몇 가지 복잡한 수술 절차의 핵심 단계들을 반복하여 보여드리겠습니다.

동물이 수술 후 회복되면, 젖산 센서와 광섬유 케이블을 적절하게 삽입하는 것이 관건입니다. 조나단과 저는 이 두 가지 정밀한 장비를 삽입하기 위해 동물을 보정할 때 손을 단단히 고정하는 방법을 시연하겠습니다. 마지막으로, 실시간으로 자극 강도를 조절하여 EEG 반응을 최적화하는 방법을 보여드리겠습니다.

본 실험에서는 청색광 민감성 양이온 채널을 발현하는 형질전환 마우스를 사용합니다. 해당 채널은 대뇌 피질 뉴런에 도입됩니다. 먼저 유도를 위해 5% isof fluorine, 95% oxygen을 사용하여 마우스를 마취시킨 후, 3% isof fluorine, 97% oxygen으로 마취 상태를 유지합니다.

양 눈 사이부터 두개골 뒷부분까지 두개골 상단에 정중 절개를 실시합니다. 과산화수소와 멸균 식염수로 두개골을 세척합니다. 전극 광유전학 자극 배치를 위한 정위 좌표를 결정하기 위해 Bregma와 Lambda를 찾아 표시합니다. 0.5 mm 볼 버(ball bur) 비트와 이어서 0.7 mm 볼 버 비트가 장착된 고속 치과용 드릴을 사용하여 나사 구멍을 뚫습니다.

일자 드라이버를 사용하여 전극 고정용 나사(kelo gram screws)를 구멍에 삽입합니다. 원하는 깊이가 될 때까지 약 4~5바퀴 정도 돌려 고정합니다. 스테레오택식 캐뉼라로 가이드 캐뉼라를 제자리에 유지한 다음, 아크릴 시멘트를 사용하여 두개골과 앵커에 부착합니다. 개통성을 유지하기 위해, 수술 시점부터 실험 시점까지 각 가이드 캐뉼라 내에 더미 캐뉼라 또는 스타일렛을 삽입해 두어야 합니다.

EEG 전극과 가이드 캐뉼라를 두개골에 배치한 후, 얇은 층의 치과용 아크릴 시멘트로 이들을 함께 고정합니다. 시멘트가 굳으면, 건조된 시멘트 둔덕 위에 플라스틱 커넥터를 배치하고, EEG 리드에서 뻗어 나온 와이어 끝부분을 플라스틱 커넥터의 접점에 납땜하여 와이어 리드가 시멘트에 고정되도록 합니다. 그 후, 21 gauge 바늘의 배럴 속으로 근전도 와이어를 밀어 넣어 핵 근육을 통해 통과시킵니다.

근육을 관통하여 와이어가 근육에서 나오는 지점 바로 원위부에 5-0 나일론 봉합사로 더블 서전 매듭(double surgeon's knot)을 묶습니다. 역절단 P3 바늘과 5-0 나일론 봉합사를 사용하여 단일 결절 봉합(single interrupted surgeon knots) 방식으로 근육 조직에 접근하기 위해 견인했던 피부를 다시 봉합합니다. MC 자극 장치의 프로그래밍이 완료되면, 이를 5V 이진 온-오프 신호를 생성하는 독립형 신호 발생기로 작동시킵니다. BNC 커넥터를 사용하여 MC 자극 장치를 레이저의 TTL 활성화 전원 장치에 연결합니다.

리본 케이블을 통해 레이저 전원 장치를 레이저에 연결하십시오. 또한, 레이저를 시작 광섬유 패치 케이블의 수형 FC 커넥터에 연결하십시오. 시작 광섬유 케이블을 회전 조인트에 연결하십시오.

정류기 광섬유 회전 조인트(Commutator Fiber optic rotary joint)는 정류기 역할을 합니다. 동물이 케이지 안에서 움직일 때, 회전 조인트가 함께 회전하여 회전 토크로 인해 광섬유 케이블이 파손되는 것을 방지합니다. 플라스틱 케이블 타이로 정류기를 동물이 수용된 원통형 케이지 상단에 배치된 금속 스탠드에 고정하십시오.

한 손으로 생쥐를 컵 모양으로 감싸 쥐어 고정합니다. 생쥐의 머리가 실험자의 중지와 검지 사이에 오도록 위치시킵니다. 이제 멸균된 25 gauge 바늘을 사용하여 가이드 캐뉼라 내부의 이물질을 제거합니다.

그 다음 광섬유 케이블을 수동으로 삽입하고 나사형 스크루 캡을 사용하여 광섬유 가이드 캐뉼라에 고정합니다. 평평하게 절단된 끝단으로부터 일정 거리에 묶은 봉합사 매듭을 통해 뇌 내 광섬유 케이블의 삽입 깊이를 조절합니다. 센서는 인산염 완충 식염수에서 보정하며, 세 가지 농도의 L lactate에 단계적으로 노출시킵니다.

제조사 프로토콜에 따라, 광섬유 케이블 삽입 절차와 동일한 방식으로 미리 보정된 센서를 두개골에 장착된 젖산 가이드 캐뉼라에 삽입하십시오. 바이폴라 플러그 커넥터를 사용하여 젖산 센서를 pinnacle 8, 400 바이오센서의 프리앰프에 연결하십시오. 그런 다음 이 프리앰프를 수술적으로 이식된 헤드 마운트의 8핀 커넥터에 부착하십시오.

데이터를 수집하기 전, 레이저 강도 조절 노브를 사용하여 광유전학적 자극의 강도를 조정하십시오. EEG 응답의 진폭은 체계적으로 연구되지 않은 요인들로 인해 동물마다 다르게 나타날 수 있습니다. 따라서 광유전학적 자극 강도를 조정하여 원하는 응답이 얻어졌을 때 EEG 응답이 적절한지 확인하는 과정이 필요합니다.

neuro score가 포함된 Pinnacle 8, 400 시스템을 사용하여 데이터를 수집합니다. SEIA 인터페이스를 통해 EEG 및 EMG 데이터 처리 과정의 시각적 검사를 수행하여 수면 상태를 분류합니다. EEG 및 EMG를 기반으로 10초 에포크 단위의 데이터를 각성, 비급속 안구 운동 수면 또는 급속 안구 운동 수면으로 분류합니다.

이 바이오센서 광유전학적 자극 구성은 외과적으로 삽입된 EEG 전극, 젖산 센서 및 광유전학적 자극용 캐뉼라를 보여줍니다. 광유전학적 자극이 없는 상태에서 이 마우스는 자연 수면을 취했습니다. EEG, EMG 및 뇌 젖산 농도가 지속적으로 모니터링되는 동안 각성 상태의 전이와 두 가지 수면 하위 유형이 관찰되었습니다.

급속 안구 운동(Rapid eye movement)과 비급속 안구 운동(non rapid eye movement)은 EEG와 EMG를 기반으로 정의됩니다. 흥미롭게도, 젖산 바이오센서 전류는 저진폭 EEG의 함수로 증가하며, 고진폭 EEG의 함수로 감소합니다. EEG의 두 채널 모두 전두엽 피질에 전달된 광유전학적 자극에 반응합니다.

이 영상을 시청한 후, 광유전학적 조작과 더불어 뇌의 뇌파, 근전도 및 젖산 농도를 동시에 측정하기 위한 마우스 수술적 임플란트 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 수술 기법을 숙달하면 90분에서 120분 이내에 적절히 수행할 수 있습니다. 마취 깊이를 측정하는 척도로서 동물의 호흡 상태를 지속적으로 모니터링해야 함을 기억하십시오.

동물의 호흡 주기가 4~5초에 한 번보다 더 길어지면 마취가 너무 깊은 상태일 수 있습니다. 반대로 호흡 주기가 2초에 한 번보다 더 짧아지면 마취가 너무 얕은 상태일 수 있습니다. 가스 마취제인 isof fluorine을 사용할 때는 적절한 안전 주의 사항을 준수해야 함을 기억하십시오.

광유전학적 자극에 사용되는 레이저로부터 망막을 보호하기 위해 수술실 내의 환기가 적절한지 확인하십시오. 보호 고글을 착용하거나 동물을 차광 캐비닛에 넣으십시오. 완전히 깨어 있는 마우스에 젖산 바이오센서와 광섬유 케이블을 이식하는 연습이 필요합니다.

마우스는 이러한 절차에 순응하지 않으므로 고정시켜야 합니다. 하지만 구속 장치가 동물을 다치게 하거나 호흡을 방해할 정도로 강해서는 안 됩니다.