인공 항원은 세포 (aAPC) 중재의 활성화와 자연 킬러 T 세포의 확장을 제시

본 절차의 전체적인 목표는 NK T 세포의 확장을 위한 CD 1D 기반 인공 항원 제시 세포(AAPC)를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 자성 비드에 단백질을 첨가하여 기능화함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 말초혈액으로부터 초기 NK T 세포 집단을 농축합니다.

다음으로, 농축된 T 세포를 A A PC와 공동 배양합니다. 마지막 단계에서는 A A PC 세포 집단의 표현형과 기능을 평가합니다. 최종적으로, 확장된 T 세포 서브셋의 순도는 유세포 분석법을 통해 결정할 수 있습니다. 수지상 세포를 사용하는 기존 방법보다 APC를 사용할 때의 주요 장점은 수지상 세포의 경우 공여자에 따른 변동성이 클 수 있다는 점입니다.

APCs는 NK T 세포의 증식을 위한 재현 가능한 기성품 형태의 표준화된 방법을 제공합니다. 저는 존스 홉킨스 대학의 Dr. Schneck 및 oaky와 함께 연구하던 중 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. 그들은 고전적인 CD8 T-세포 하위 집합의 증식을 위해 인공 항원 제시 복합체를 사용하는 분야를 개척했습니다.

시연은 박사후 연구원인 Dr. James East와 제 실험실의 연구원인 Dr. Wendy의 아들이 진행하겠습니다. 먼저 1 mL의 dyna bead M four 50 epoxy beads를 5 mL 투명 붕규산 유리 나사 캡 바이알에 옮깁니다. 그런 다음 별도의 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에서 3 mL의 멸균 bore eight buffer로 비드를 헹굽니다.

100 µg의 인간 CD 1D IG dimer와 20 µg의 원하는 공자극 분자를 1 mL의 칼슘 및 마그네슘 제거 PBS에 추가합니다. 다음으로, 비드가 들어 있는 유리 바이알을 자석 위에 놓고 붕산 완충액을 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 단백질 혼합물을 유리 바이알에 넣고 캡을 닫습니다.

바이알을 뒤집어 즉시 용액을 혼합한 후, 캡을 파라필름으로 덮고 4 °C의 로테이터에서 하룻밤 동안 보관합니다. 다음 날, 유리 바이알을 다시 자석 위에 올리고 비즈가 섞이지 않도록 주의하며 단백질 혼합물을 제거합니다. 비즈 세척 버퍼 3 mL를 추가하고 4 °C의 로테이터에서 5분 동안 인큐베이션하는 과정을 통해 비즈를 3회 세척합니다.

단백질이 비드에 안정적으로 로딩되었는지 확인하기 위해, 비드 일부를 항체로 염색한 후 유세포 분석법으로 분석합니다. 이제 5 × 10⁷ 개의 비드를 1.5 mL 소형 유리 바이알로 옮기고 1 mL의 멸균 PBS로 비드를 세척합니다. 그 후 사용 48~72시간 전에 처리합니다.

비드가 항원으로 로딩되는 동안, 1 mL의 멸균 PBS 내에서 세척된 비드에 항원을 로딩합니다. 먼저 헤파린 처리된 공여자의 혈액을 실온에서 동일한 부피의 PBS로 희석하여 PBMC를 수집합니다. 그 다음, 실온의 PHI 15 mL를 50 mL 원추형 튜브에 넣고, 희석된 혈액 혼합물 25 mL를 PHI 층 위에 천천히 층분리하여 얹습니다.

그 후 브레이크를 끈 상태에서 실온, 700 ×g로 30분간 샘플을 원심분리합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 림프구 인터페이스 층을 새로운 50 mL 원추형 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 다음으로 50 mL의 PBS로 림프구를 세척하고 상층액을 제거하며, 동일한 공여자의 튜브들을 하나의 튜브로 합칩니다.

PBMC를 20 milliliters의 PBS로 다시 세척한 후, 세포 수를 측정하고 max buffer를 사용하여 5 × 10⁷ cells/milliliter 농도로 재부유시킵니다. T세포 분획을 분리하기 위해, EP human T-cell enrichment kit의 PAN T-cell enrichment solution 100 microliters를 PBMC 2 milliliters와 함께 상온에서 10분 동안 배양합니다. 그 다음, 해당 용액을 자성 비드(magnetic beads) 100 microliters와 함께 상온에서 10분 더 배양합니다.

용매의 최종 부피를 2.5 milliliters로 맞춘 다음 튜브를 자석에 놓습니다. 5분 후, CD3 양성 분획을 15 milliliter 원뿔형 튜브에 빠르게 붓습니다. 이제 5 milliliters의 차가운 max buffer로 세포를 세척하고, 생존 세포 수를 측정합니다.

먼저 CD 1 61 양성 세포를 선택하기 위해 염색용 분주액을 제거합니다. 농축된 T 세포를 980 µL의 얼음처럼 차가운 max buffer에 재부유시킨 후, 10 µg의 anti CD 1 61 단클론 항체와 함께 4 °C에서 10분 동안 배양합니다. 세포를 세척한 후 펠릿을 800 µL의 max buffer와 200 µL의 anti-US IgG one microbeads로 재구성합니다.

이 용액을 4°C에서 10분 동안 더 배양합니다. 세포를 마이크로비즈와 함께 배양하는 동안, LS 컬럼을 평형화하기 위해 3mL의 max buffer를 첨가합니다. 해당 세포 분획을 세척한 후, 3mL의 max buffer에 든 세포를 컬럼에 천천히 피펫으로 분주합니다.

이제 컬럼을 3 mL의 신선한 max buffer로 세 번 헹굽니다. 그런 다음 신선한 max buffer 3 mL를 컬럼에 더 추가하고, 컬럼을 15 mL 원심 분리 튜브(conical tube)로 옮깁니다. 정제된 CD161 양성 CD3 양성 세포를 밀어내어 회수하고, NKT 세포가 농축된 분획의 수를 측정합니다.

농축된 10⁶개의 CD161 양성 CD3 양성 T 세포와 10⁶개의 APC를 16 mL의 완전 배지가 담긴 플레이트에서 공동 배양함으로써 이 단계를 시작합니다. 공동 배양액 160 µL를 저증발 덮개가 있는 조직 배양 처리된 폴리스티렌 U-바닥 96-웰 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 12~14일째에 세포를 회수하고 수를 측정합니다. 유세포 분석으로 세포 집단을 분석한 후, 다시 분주하여 공동 배양합니다.

방금 시연한 바와 같이, 2차 확장에 따른 추가 NKT 세포는 동결 보존합니다. AAPC 세포의 기능을 테스트하려면, 먼저 96-well U-bottom 플레이트의 well당 5×10⁴개의 NKT 세포와 5×10⁵개의 AAPC를 최종 부피 200 µL의 완전 배지에 넣고 공동 배양합니다. 24~48시간 후, ELISA 분석을 위해 세포 배양 상층액을 수집합니다. 이 첫 번째 그림은 여기에서 보는 바와 같이 CD1D IG 단백질이 자기 비드 표면에 안정적으로 고정되었음을 보여줍니다.

이 그래프에서 나타난 바와 같이, CD 1D IG와 anti CD 28 항체는 모두 자성 비드의 표면에 발현되어 있습니다. V α14 양성 마우스 NK T 세포 하이브리도마 DN 30 2D 3을 매질에 용해된 α-galera 항원이 적재되지 않은 APC 또는 α-gal이 적재된 APC와 함께 공배양하였습니다. 이후 배양 상층액을 수확하고, ELISA로 IL-2 생산량을 측정하여 각 항원 제시 세포 배치를 테스트하는 간단한 방법을 제공하였습니다. 본 실험에서는 자성 비드 분리법을 통해 인간 CD 1 61 양성 CD 3 양성 말초혈액 T 세포를 농축하였습니다.

그 후 세포를 alpha galera가 탑재된 A A PC로 14일 동안 일주일에 한 번씩 자극하고, V alpha 24 및 V beta 11 발현을 분석하였습니다. 중요한 점은, 초기 NKT 세포 집단이 0.03%로 비교적 낮았음에도 불구하고, 세포를 약 67%의 V alpha 24 양성 V beta 11 양성 집단으로 증식시킬 수 있었다는 것입니다. 여기서는 96-well U-bottom 플레이트에서 Alpha Gal SER 항원의 존재 또는 부재 하에 C one R CD 1D 세포를 표시된 비율의 NKT 세포와 함께 20~24시간 동안 배양하였습니다.

B 세포 림프종 세포주의 NKT 세포 매개 세포 용해는 크롬 방출 분석법으로 평가하였습니다. PC 확장 NKT 세포는 이 림프종 세포주를 용해할 수 있었습니다. 알파 갈렉토세라마이드(alpha galactosylceramide)의 존재 또는 부재 하에, 건강한 자원봉사자와 암 환자 모두의 PBMC로부터 NKT 세포를 확장하였으며, 알파 갈렉토세라마이드를 처리하였습니다.

A PC를 통해 두 그룹 모두에서 NKT 세포 집단을 확장할 수 있었습니다. 200만 개의 CD161 양성 CD3 양성 T 세포를 초기 집단으로 사용했을 때, 두 차례의 확장 과정을 거쳐 10⁷개 이상의 세포를 얻을 수 있었습니다. 이렇게 확장된 NKT 세포는 본 실험에서 보여준 바와 같이 기능 연구에 활용될 수 있습니다.

ex vivo로 증식된 NKT 세포는 Alpha GAL 자극에 계속 반응하며 IL 17 A, TNF alpha 및 interferon gamma를 강력하게 생성합니다. 초기 T 세포 농축 집단이 적고 두 번째 CD 1 61 농축 단계를 수행할 수 없는 경우, A A PC 매개 증식이 예상된 결과를 얻지 못할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 하지만 순환 NKT 세포의 비율이 0.1%보다 높다면, invariant NKT 세포를 충분히 증식시킬 수 있을 것입니다.

종합적으로, 이러한 데이터는 CD 1D 기반 A A PC가 일차 인간 NK T 세포를 효과적으로 증식시키고 자극하는 데 사용될 수 있음을 입증합니다. 이 절차 이후에는 NK T 세포 활성화의 역학은 어떠한가와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 QPCR과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 간 질환 분야의 연구자들이 지방간 질환에서 NKT 세포의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.