인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

이 절차의 전반적인 목적은 두 가지 방법을 사용하여 영구치로부터 인간 치수 줄기세포를 분리, 특성화 및 분화시키는 것입니다. 이는 건강한 매복 사랑니를 수집한 후, 우선 백세질-법랑질 경계 부위 주변을 절단함으로써 수행됩니다. 치수 줄기세포인 DPSCs는 두 가지 서로 다른 방법을 통해 분리됩니다.

첫 번째 방법에서는 polyp 조직을 collagenase type one과 disc space solution에 넣고 배양하여 효소적으로 소화시킵니다. 여기서는 이를 ed라고 부릅니다. 두 번째 방법의 분리 방식에서는 palp 조직을 소화 과정 없이 플라스크에 바로 넣습니다.

이러한 방식으로 dpss는 조직에서 플라스크로 이동하기 시작합니다. OG라고 불리는 이 세포들은 외성장 분리법(outgrowth isolation method)을 의미합니다. 절차의 두 번째 단계는 유세포 분석법(flow cytometry)을 이용한 줄기세포의 식별입니다.

절차의 세 번째 단계는 odontoblast 분화 유도이며, 마지막 단계는 Alizarin Red 염색과 qPCR을 통해 두 그룹 간의 odontoblast 분화를 비교 평가하는 것입니다. 저는 Rian Institute 줄기세포 및 발생생물학과 소속의 RA Kde입니다. 오늘은 두 가지 방법을 사용하여 인간 중간엽 줄기세포의 분리, 특성 분석 및 비교 분화 과정을 보여드리겠습니다.

안녕하세요, Rio 연구소의 Rezaian 박사입니다. 저희는 인간 치수 줄기세포와 관련된 프로젝트를 진행하고 있습니다. 이 세포들은 일종의 중간엽 줄기세포로, 통증과 이환율을 최소화하여 쉽게 얻을 수 있다는 장점이 있습니다.

중배엽 줄기세포는 가소성 있는 분화 능력, 콜로니 형성 및 다분화 능력을 통해 특성화됩니다. 안녕하세요, 줄기세포학과의 Ami 박사입니다. 저희 연구소에서는 연구 및 향후 응용을 목적으로 줄기세포를 분리하기 위해 실험실에서 이 절차를 사용하고 있습니다.

재생 의학에서 향후 줄기세포 기반 치료를 위해 이러한 줄기세포원을 사용하기 위한 첫 번째 단계는 인체 조직에서 줄기세포를 분리하기 위한 최적의 프로토콜을 선택하는 것입니다. 이 목표를 달성하기 위해서는 서로 다른 줄기세포 분리 조건하에서의 세포 행동의 특정 측면을 조사하는 것이 매우 중요합니다. 먼저, 치수 조직의 효소적 해리 또는 조직 이식편으로부터의 줄기세포 외성장법을 사용하여 인간 치수 줄기세포를 분리하겠습니다.

그 다음, 이를 특성화하고 오겐 블라스트(ogen blast)로 분화시킵니다. 그럼 시작해 보겠습니다. 먼저, space와 collagenase Type one을 각각 PBS에 용해합니다.

그 후 0.2 micron 시린지 필터를 사용하여 여과합니다. 두 용액을 모두 원추형 튜브(conical tube)에 옮깁니다. 그런 다음 pener와 PBS를 첨가하여 최종 농도를 맞춥니다.

건강한 사랑니를 멸균 조건 하에서 차가운 기본 배지에 담아 실험실로 운반하십시오. 분석 전 70% ethanol로 치아 표면을 세척하십시오. 치아 표면의 이물질이 완전히 제거되었는지 확인하십시오.

멸균된 치과용 디스크를 사용하여 백시질-법랑질 경계(cement enamel junction) 부위의 치아를 절단하여 치수강을 노출시킵니다. 치과 조직의 과열을 줄이기 위해 절단 과정은 천천히 수행해야 합니다. 그런 다음 Scarpa 블레이드를 사용하여 치수 조직을 치관에서 부드럽게 분리하고, 치수 조직을 1~2mm 크기의 조각으로 나눕니다.

작은 치수 조직 조각들을 1 mL의 효소 용액에 넣고 37 °C에서 1시간 동안 배양하며, 치수 조직의 분해를 돕기 위해 30분마다 vortex를 수행합니다. 그 후, 70 µm 셀 스트레이너(cell strainer)에 통과시켜 큰 응집물을 제거합니다. 그런 다음 PENER가 포함된 PBS를 첨가하고 1,200 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다.

상층액을 조심스럽게 제거합니다. 그 다음 플레이트를 증식 배지에 현탁하여 배양 플라스크로 옮기고 배지를 추가합니다. 이후 배양합니다.

아웃워크(outwork) 방법을 위해 세포 합류도(confluence)가 달성될 때까지 3일마다 배지를 교체하십시오. 절단 과정을 반복합니다. 치아 절단 후에는 조직을 1~2mm 크기의 조각으로 분쇄합니다.

그다음 이를 배양 접시에 넣습니다. 증식 배지를 빠르게 채우고 배양합니다. 세포가 추가로 증식하여 퍼져 나갈 수 있도록, 증식 배지의 총 부피가 모든 조각의 부착을 지원할 수 있는 수준이어야 함을 고려해야 합니다.

세포 성장을 관찰한 후, 세포 합류(confluence)가 이루어질 때까지 3일마다 배지를 교체하십시오. 면역표현형 분석을 위해, 두 종류의 D PSCs를 PE 또는 FITC가 접합된 항체와 함께 4°C의 암소에서 30분 동안 배양합니다. 그 다음 PBS를 첨가하고 1,200 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다.

상층액을 제거하고 PBS로 플레이트를 세척한 후, 유세포 분석기를 사용하여 표면 마커를 평가합니다. 두 종류의 DPC를 3세대까지 계대 배양합니다. 그 다음 트립신을 처리하고 60% 밀도로 6개의 적색 배양 접시에 분주한 후, PM을 치성 분화 배지로 교체합니다. 3개의 웰은 PM을 첨가하여 음성 대조군으로 유지합니다.

3일마다 배지를 교체하고, 21일째에 PBS로 세포를 세척하십시오. 그 후 웰당 1mL의 10% 포름알데히드(formal gel height)를 사용하여 상온에서 15분 동안 고정하십시오.

15분 후, 고정액을 조심스럽게 제거하고 증류수로 세포를 3회 세척합니다. 그런 다음 물을 1mL의 red alza 적색 염색액으로 교체합니다. 20분 후, 과량의 염료를 제거하고 탈이온수로 세포를 4회 세척합니다.

그 후 세포가 건조되는 것을 방지하기 위해 웰당 1 mL의 물을 추가합니다. 염색 후 현미경으로 관찰하면 대조군과 비교하여 세 개의 상단 레일이 붉은색으로 변한 것을 확인할 수 있으며, 고배율로 세포 주변의 염색 색소 흡수 양상을 관찰하여 붉은색 염색 정도를 정량화할 수 있습니다. 물을 제거한 후, 웰당 1 mL의 10% 아세트산을 추가하고 흔들어주며 30분 동안 배양합니다.

그다음 셀 스크레이퍼를 사용하여 플레이트에서 세포를 부드럽게 긁어냅니다. 그런 다음 이를 각각의 튜브로 옮깁니다. 30초 동안 격렬하게 볼텍싱(VOR)합니다.

그다음 85 °C에서 10분 동안 가열합니다. 증발을 방지하기 위해 튜브를 파라필름으로 밀봉한 후 얼음에 5분 동안 둡니다. 이후 20,000 ×g에서 15분 동안 원심분리합니다. 그동안 실험 프로토콜에 따라 알리자린 레드 표준 연속 희석액을 조제합니다.

원심분리 후, 상층액을 제거하여 새 튜브로 옮깁니다. 10% ammonium hydrocyte를 사용하여 pH를 중화합니다. 그 다음, 표준 시료와 검체를 96-well 플레이트에 첨가합니다.

웰 플레이트에 분주한 후 405 nanometer에서 흡광도를 측정하고 표준 연속 희석법에 따라 데이터를 분석합니다. 여기서는 10일, 15일 및 18일에 효소 해리를 통해 분리한 DPSCs와 5일, 10일, 13일 및 18일에 외성장(outgrown)시킨 DPSCs를 볼 수 있습니다. 단계 3의 두 DPSC 유형은 크기와 형태가 거의 동일합니다. 면역표현형 분석 결과, CD 44, CD 73 및 CD 19와 같은 중간엽 줄기세포 마커는 존재하며, CD 34, CD 45 및 CD 11 B와 같은 조혈 및 내피 마커는 부재함을 보여줍니다. 흥미롭게도, CD 1 0 5와 CD 146의 발현은 DPSCED에 비해 외성장된 DPSCs에서 더 높게 나타납니다. 오돈토블라스트(odontoblast) 분화 21일째의 Alizarin Red 염색 정량 결과, DPSCED가 외성장되지 않은 줄기세포에 비해 더 많은 칼슘 침착을 보임을 알 수 있습니다.

QPCR 결과는 또한 D-P-S-C-D에서 무기질화 마커인 MEP 및 ALP의 발현이 유출성 치아 줄기세포에 비해 유의하게 더 높음을 나타냅니다. 한편, 두 유전자 모두 분화 과정 동안 조절되었으며, 치성 마커인 DSPP의 발현 또한 분화 과정 동안 증가했습니다. 그러나 ED 그룹과 OG 그룹 간의 분화된 세포에서 DSPP의 발현에는 유의미한 차이가 없었습니다.

지금까지 치수 조직의 효소적 해리 또는 조직 절편으로부터의 줄기세포 외성장을 이용하여 인간 치아 유래 줄기세포를 분리하는 방법을 살펴보았습니다. 이것으로 모든 과정을 마칩니다. 여러분의 실험에 이 절차를 성공적으로 적용하시길 바랍니다.

감사합니다.