효소 세포 융합 분석을 사용하여 올가미로 인한 막 퓨전 분석

이 절차의 전반적인 목적은 beta galacto의 활성화된 발현을 통해 snare 매개 세포 융합 이벤트를 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 cost seven 세포 표면에 v 및 t snare 단백질을 외인성으로 발현시킴으로써 수행됩니다. 이 절차의 다음 단계는 V snare 단백질을 발현하는 세포와 T snare 단백질을 발현하는 세포를 결합하는 것입니다.

그 결과 snare 매개 세포 융합과 beta galacto의 활성 발현이 일어납니다. 최종적으로, 세포 융합으로 유도된 beta galacto 활성은 분광광도계를 사용하여 측정합니다. 이 기술 또는 현미경 SAL 영역 분석과 같은 기존 방법의 주요 장점은 여러 snare 조합을 분석할 수 있다는 점입니다.

정량적으로, 이 방법은 snare 매개 막 융합의 메커니즘과 조절을 이해하는 데 적용될 수 있습니다. 또한, 처리량 연구(throughput studies)에도 적용 가능합니다. 실험 절차 시연은 제 연구실의 박사후 연구원인 Doc Na Hassan과 테크니션인 David Humphrey가 수행하며, 트랜스펙션 로드 전날에 진행됩니다.

12mm 유리 커버 슬립이 포함된 24웰 플레이트를 준비하고, 실험에서 고유한 플라스미드를 발현하는 세포들의 각 조합당 두 개의 웰을 준비합니다. 4.5 g/L의 glucose와 10% FBS가 첨가된 DMEM에서 배양된 COST7 세포 30,000개를 각 커버 슬립에 분주합니다. V 세포를 형질전환시키기 위해 각 웰에 0.25 µg의 TTA 플라스미드와 한 세트의 발현 플라스미드를 첨가합니다.

이 경우 관심 대상인 flipped 단백질, 즉 flipped vamps를 T 세포에 형질전환시키기 위해 TRE lacks Z를 인코딩하는 플라스미드 0.25 µg과 flipped 단백질인 snap 25, syntaxin one 및 syntaxin four를 인코딩하는 상보적 플라스미드 세트를 첨가합니다. 이제 제조사의 지침에 따라 lipofectamine으로 cost seven을 형질전환하고 세포를 24시간 동안 배양합니다. 형질전환 24시간 후, 보충된 paraformaldehyde로 세포를 10분 동안 고정합니다. 고정 후, PBS++로 세포를 3회 세척한 다음, 보충된 FBS로 세포를 30분 동안 블로킹합니다.

블로킹 후, cells를 anti mic 단클론 항체 Nine E 10과 함께 30분 동안 반응시킵니다. PBS++로 4회 세척한 후, 1:500으로 희석한 fitzy 접합 2차 항체와 함께 cells를 1시간 동안 반응시킵니다. PBS++로 4회 더 세척한 후, 표지된 cells를 시판되는 anti-fade 시약으로 마운팅합니다.

이제 세포를 공초점 현미경으로 관찰할 준비가 되었습니다. transfection 전날, 분석할 각 플라스미드 조합당 100mm 조직 배양 접시에는 120만 개의 Cos-7 세포를, 6-well 플레이트의 각 well에는 20만 개의 Cos-7 세포를 분주하십시오. 한 개의 well을 준비하여 세포를 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, transfection을 위해 플라스미드를 첨가합니다. V 세포의 경우, 각 100mm 배양 접기의 세포에 목적 Flippase 단백질을 발현하는 플라스미드와 5µg의 pTet-off를 transfection하십시오.

100 mm 배양 접시의 대조군 세포에 빈 벡터와 P te off를 V 세포와 동일한 상대 농도로 공동 형질전환합니다. 모든 플라스미드가 V 세포와 대조군 세포에 첨가되면, vamps의 N-당화(N-glycosylation)를 억제하기 위해 해당 웰에 tcom mycin을 첨가합니다. 6-웰 플레이트의 각 웰에서 관심 단백질을 발현하는 상보적 플라스미드가 포함된 1 µg의 PBIG를 T 세포에 공동 형질전환합니다.

이제 제조사의 지침에 따라 lip을 사용하여 cost seven 세포를 형질전환하십시오. 그 후 세포를 24시간 동안 배양하고, 형질전환 24시간 후에 효소 없는 세포 해리 버퍼를 사용하여 배양 접시에서 V 세포를 떼어내십시오. 먼저 20 milliliters의 PBS로 세포를 한 번 세척하는 것으로 시작하십시오.

그 다음 효소 제거 해리 버퍼(enzyme free dissociation buffer) 5 mL를 첨가합니다. 실온에서 10분간 배양한 후, 플레이트를 강하게 두드려 세포를 떼어내고 현미경으로 세포가 분리되었는지 확인합니다. 세포의 절반 미만이 분리되었다면, 5분 더 기다린 후 플레이트를 다시 두드립니다.

세포의 절반 이상이 떨어져 나올 때까지 분리 버퍼에서 배양을 계속합니다. 그런 다음 혈구계수기로 V 세포의 수를 측정합니다. 이후 보충제(supplemented)가 첨가된 헤이즈 버퍼 DMEM에서 V 세포를 mL당 약 480,000 cells의 농도로 재부유시킵니다.

이제 T 세포가 들어 있는 각 웰에 재현탁된 V 세포 1 mL를 추가하고 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣으십시오. 세포를 6, 12 또는 24시간 동안 공동 배양한 후, PBS로 세척하고 용해 버퍼를 추가합니다. 다음으로, 웰에서 세포를 긁어내어 원심분리를 위해 튜브로 옮깁니다.

원심분리 후 상층액을 새 튜브로 옮기고, 해당 프로토콜의 제조사 지침에 따라 시판되는 분석 키트를 사용하여 beta galacto의 발현량을 측정하십시오. 이때, 결과 점수를 매기기 위해 1 M sodium carbonate를 첨가하여 90분 후 콜레라 메트릭 반응을 반드시 중단시키십시오. 분광광도계를 사용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하십시오. CO seven 세포에 flipped snare 플라스미드를 형질전환했을 때, 세포 표면에서 flipped snare 단백질이 발현되었습니다.

세포 표면의 snare 단백질 발현 수준을 측정하기 위해 유세포 분석법(Flow cytometry)을 사용하였습니다. 막 융합 능력을 비교하기 위해서는 vamp가 동일한 수준으로 발현되어야 했습니다. 따라서 transfection에 사용된 각 flipped snare 플라스미드의 농도를 적정하여 transfection 조건을 최적화하였습니다.

이러한 조건 하에서, vamps 1, 3, 4, 5, 7, 8과 syntaxin 1 및 4가 각각 세포 표면에서 동일한 수준으로 발현되었으며, 시냅스 엑소사이토시스(synaptic exocytosis)를 매개하는 뉴런 SNARE를 사용하여 해당 분석법의 타당성을 테스트하였다. 실제로 vamp 2를 발현하는 V 세포와 SYNTAXIN 1 및 SNAP-25를 발현하는 T 세포를 결합했을 때, 강력한 beta-galactosidase 발현이 검출되었다. 그러나 vamp 2 또는 SNAP-25 중 어느 하나라도 발현되지 않았을 때는 기저 수준의 beta-galactosidase 활성만이 검출되었으며, 이는 세포 융합과 beta-galactosidase의 발현이 v-SNARE와 t-SNARE 간의 상호작용에 의존함을 나타낸다. 전반적으로 SYNTAXIN 1, SNAP-25, vamp 1, vamp 3, vamp 8이 비슷하게 가장 높은 융합 활성을 보였다.

반면, 기저 beta GAL 활성은 해당 단백질 조합이 vamp 5와 SYNTAXIN 1의 사례와 같은 막 융합을 유도하지 않음을 시사합니다. Snap 25. 효소적 융합 분석을 수행할 때, SNARE 단백질의 N-당쇄화를 방지하기 위해 tunicamycin을 첨가하고, SNARE 단백질 간의 이황화 결합 형성을 방지하기 위해 DTT를 첨가해야 함을 기억하는 것이 중요합니다.

이 영상을 시청한 후에는 세포 융합 분석법을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.