E4orf4 - 유도 세포 사망에 최저 효과의 유전자 발현 및 측정의 조건부 최저위한 셀 라인의 작성

다음 실험의 전반적인 목표는 ACF1 또는 SNF2H 넉다운이 E4 또는 four로 유도된 세포 사멸에 미치는 영향을 관찰하는 것입니다. 이는 doxycycline 첨가에 의해 ACF1 또는 SNF2H srna 발현이 조건부로 활성화되어 두 번째 단계에서 ACF1 또는 SNF2H 단백질 수준이 감소하도록 설계된 세포주를 제작함으로써 달성됩니다. 이렇게 얻어진 세포주의 세포들을 doxycycline으로 처리하여 ACF1 또는 SNF2H 발현을 감소시키거나, 처리하지 않은 상태로 둡니다.

다음으로, shRNA 내성 ACF1 또는 SNF2H이 있는 또는 없는 세포에서 E4orf4를 발현시켰습니다. E4orf4로 유도된 세포 사멸에 미치는 ACF1 또는 SNF2H의 영향을 조사하기 위해, JY 분석법을 이용하여 apoptotic 형태의 핵을 계수한 결과를 바탕으로 E4orf4 독성에 미치는 ACF1 또는 SNF2H 수준의 영향을 확인하였습니다. RNA의 일시적 형질전환과 같은 다른 방법들에 비해 이 기술의 주요 장점은 모든 세포가 shRNA를 발현하며, 전통적인 플라스미드와 함께 공동 발현하는 세포의 비율이 더 높다는 것입니다. 이 방법은 E4orf4로 유도된 세포 사멸의 기저 메커니즘에 대한 통찰을 제공하며, 다른 프로테이틱 단백질 연구에도 적용될 수 있습니다.

Ana Lafe 외에도 제 실험실의 연구원이 이 절차의 일부를 시연할 예정입니다. 유도성 세포주 생성을 위한 절차를 시작하려면, 테트라사이클린이 없고 5 µg/mL의 blasticidin이 포함된 혈청 함유 DMEM 8 mL에 T-Rex 2 9 3 세포를 10 cm 플레이트당 약 5 × 10⁶ cells 밀도로 플레이팅합니다. 플레이트를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, transfection 전에 8 mL의 신선한 배지로 교체합니다. transfection에 사용할 플라스미드는 tetracycline-inducible H1 프로모터에 의해 구동되는 ACF1 또는 SNF2H shRNA를 인코딩하는 P-supneo-GFP 플라스미드이며, 여기에는 constitutive PGK 프로모터에 의해 구동되고 GFP와 융합된 네오마이신 저항성 유전자가 포함되어 있습니다.

150 millimolar 염화나트륨 500 microliters에 10 micrograms의 플라스미드 DNA를 넣고 볼텍싱합니다. 그런 다음, 다른 튜브에 150 millimolar 염화나트륨 500 microliters와 함께 DNA 1 microgram당 2 microliters의 jet PY 시약을 넣고 볼텍싱합니다. DNA 용액에 jet pie 용액을 추가하고 볼텍싱하여 잘 섞습니다.

실온에서 15분 동안 배양합니다. 15분 후, 70~80% 합류도(confluence)에 도달한 10cm 플레이트에 DNA 복합체를 조심스럽게 파이펫으로 분주합니다. 다음 날 T-Rex 2 9 3 세포를 혼합합니다.

배지를 이전에와 같이 G418 500 µg/mL이 포함된 선택 배지(이 예에서는 DMEM)로 교체합니다. 이후 2주 동안 세포를 관찰합니다. 콜로니가 나타날 때까지 3~4일마다 선택 배지를 동일한 새 배지로 교체합니다.

육안으로 콜로니를 확인하고, 색상 마커를 사용하여 플레이트 바닥에 그 위치를 표시합니다. 현미경 하에서 콜로니들이 충분히 서로 떨어져 있는지 확인합니다. 콜로니는 현미경 없이도 시각화될 수 있을 만큼 충분히 커지면 분리할 수 있습니다.

이 절차를 성공시키기 위해서는 콜로니 분리 시 서로 충분히 떨어진 콜로니를 선택하는 것이 중요합니다. 무균 후드 내에서 플레이트의 배지를 흡입하여 제거하십시오. PBS로 가볍게 헹군 후 남아 있는 모든 액체를 완전히 흡입하여 제거하십시오.

플레이트 위의 콜로니 하나에 0.25% trips in EDTA 3 µL를 가하고, 세포가 플레이트에서 떨어져 나올 때까지 trips를 반복적으로 파이펫팅합니다. 분리된 세포를 24-웰 플레이트의 웰에 담긴 선택 배지로 옮깁니다. 플레이트 위의 다른 여러 콜로니에 대해서도 이 과정을 반복합니다.

세포가 웰을 가득 채울 때까지 37°C, 5% CO₂ 조건에서 배양합니다. 그 후, 각 원래의 콜로니에서 세포를 분할하여 별도의 12-웰 플레이트의 3개 웰에 각각 나누어 담고, 다음 날까지 하룻밤 동안 배양합니다. 한 플레이트의 배지를 이중 증류수로 조제한 스톡 솔루션에서 유래한 1 µg/mL doxycycline이 포함된 배지로 교체합니다.

대조군 플레이트의 배지를 doxycycline이 없는 배지로 교체합니다. 세포를 37°C, 5% CO₂ 조건에서 72시간 동안 배양합니다. 이후 처리군과 미처리군 웰에서 각각 세포를 수확하여 western blot 분석을 통해 ACF1 또는 SNF2H의 knockdown 효율을 확인하며, 대표적인 결과가 여기에 제시되어 있습니다.

이 블롯은 SNF2H 및 alpha tubulin 항체로 염색되었습니다. 후자는 두 클론의 로딩 컨트롤로 사용되었습니다. 4번과 5번 클론은 doxycycline 유도 시 SNF2H의 강한 감소를 보였으며, 따라서 다음 세그먼트에서 시연될 넉다운 실험에 사용하기 위해 선택되었습니다.

세 번째 플레이트의 처리되지 않은 세포는 선택된 세포주를 증식시키는 데 사용되며, 해당 세포의 일부를 나중에 동결 보관합니다. 선택 배지가 담긴 10 cm 플레이트에서 ACF1 또는 SNF2H 세포의 knockdown을 유도하여 추가로 사용하려면, 플레이트의 절반에 1 µg/mL의 doxycycline을 첨가하고 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 48~72시간 동안 배양합니다. 각 플레이트 그룹은 각 시점당 DPI 분석을 위한 2개의 중복 시료를 포함하여 12개의 6 cm 플레이트 분량의 세포와 각 샘플의 western blot 분석을 위한 플레이트 1개를 제공해야 합니다.

유도 후 48~72시간 뒤에 각 세포군에서 트립신을 사용하여 세포를 떼어내고, 세포 수를 센 후 6 cm 플레이트당 1.5 × 10⁶개의 세포를 독시사이클린 포함 또는 제외 배지로 분주합니다. 세포를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양한 후, 다음 날 명시된 대로 세포를 형질전환합니다.

미처리 세포와 doxycycline 처리 세포 모두 네 가지 방식으로 3반복하여 transfection을 수행합니다. 첫 번째는 공벡터(empty plasmid)와 GFP 발현 플라스미드를 이용하고, 두 번째는 공벡터와 SHRA 내성 ACF1 GFP 또는 SNF2 HGFP 발현 벡터를 이용하며, 세 번째는 E4를 인코딩하는 플라스미드를 이용하고, 네 번째는 GFP 발현 플라스미드와 E4 인코딩 플라스미드 및 SHRA 내성 ACF1 GFP 또는 SNF2 HGFP 발현 벡터를 모두 이용합니다. transfection 후, 모든 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다.

세포 트랜스펙션 다음 날, Western blot 분석을 위해 샘플당 한 개의 플레이트에서 단백질을 추출하여 ACF one 또는 SNF two H가 효율적으로 넉다운되었는지, 그리고 E four 또는 four가 서로 다른 샘플에서 동일하게 발현되었는지 확인합니다. 나머지 16개의 플레이트는 DPI 분석에 사용됩니다. DPI 분석용 플레이트의 배지를 흡입하여 제거하고, 화학 흄 후드 내에서 PBS로 세포를 부드럽게 세척합니다.

PBS로 준비된 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 1mL를 첨가하여 세포를 덮고, 흔들지 않은 상태로 상온에서 15분 동안 배양합니다. 파라포름알데히드를 흡입하여 제거하고, 상온에서 5분 동안 흔들며 PBS로 세척합니다. 이 세척 과정을 두 번 더 반복하여 총 3회 세척한 후, -20°C로 보관된 80% 에탄올(Ethanol)로 세척하고 -20°C에서 최소 1시간 동안 배양합니다.

에탄올을 흡입하여 제거하고, 상온에서 5분 동안 흔들어주며 PBS로 세포를 2회 세척합니다. 그 후 0.5%BSA와 0.05% Tween 20이 함유된 PBS(P-B-S-B-T)로 상온에서 5분 동안 1회 세척하며, 비특이적 항체 결합을 방지하기 위해 계속 흔들어줍니다. 10% 염소 혈청이 포함된 P-B-S-B-T 완충액 1mL에서 상온으로 20분 동안 흔들어주며 세포를 블로킹합니다.

그 다음 세포를 P-B-S-B-T로 5분씩 2회 세척합니다. 이번 실험에서는 1mL의 P-B-S-B-T에 희석한 1차 항체(E4 또는 4 특이적 항체)와 함께 세포를 실온에서 흔들어주며 1시간 동안 배양합니다. 이후 P-B-S-B-T로 2회, 0.1% BSA가 포함된 PBS로 1회, 각각 5분씩 세척합니다.

다음으로, 적절한 2차 형광 표지 항체와 0.5 µg/mL의 최종 농도로 DPI가 포함된 0.1% BSA 함유 PBS 1 mL를 세포에 첨가합니다. 상온의 암소에서 흔들어주며 40분 동안 배양합니다. 마지막으로, PBS로 5분 동안 세척합니다.

흡입으로 웰을 건조시킨 후, 완전히 건조될 때까지 플레이트를 뒤집은 상태로 1시간에서 하룻밤 동안 유지하고 알루미늄 호일로 덮습니다. Flora Mount G 용액을 사용하여 세포 위에 커버 슬라이드를 장착합니다. 계수할 때까지 플레이트를 4°C의 암소에 보관하십시오. 프로토콜에 설명된 다양한 처리를 거친 세포의 세포사멸 핵은 형질전환된 세포의 핵을 시각화하기 위해 E4 또는 4 특이적 항체와 DPI로 고정 및 염색되었습니다.

이 그림은 E4OR4와 GFP를 발현하는 세포의 예를 보여줍니다. 패널 A는 GFP 단백질만 발현하는 대조군을 나타내며, 패널 B는 E4OR4의 발현을 보여줍니다. 패널 C에는 DAPI로 염색된 핵이 나타나 있으며, 패널 D에는 병합된 이미지가 표시되어 있습니다. 흰색 화살표는 세포 사멸 형태의 핵을 포함하는 GFP 및 E4OR4 형질전환 세포를 나타냅니다. 빨간색 화살표는 세포 사멸 핵으로 계산되지 않는 불규칙한 모양의 핵을 나타내며, 별표는 분열기 핵 또는 막 분열한 핵을 나타냅니다. 테스트의 객관성을 최적으로 유지하기 위해, DAPI 염색으로 시각화된 응축되거나 조각난 핵의 수를 측정하여 형질전환 세포 집단 내에서 세포 사멸 형태를 보이는 핵의 백분율을 계산하였습니다.

다양한 샘플에서 apoptotic nucleo의 수 측정은 계수자가 샘플의 정체를 알지 못하는 블라인드 방식으로 수행되었습니다. 대표적인 결과가 이 그래프에 나타나 있습니다. E four or four 발현 세포에서 더 높은 비율의 핵 이상이 관찰되었으며, 이는 T four or four가 세포 사멸을 유도함을 확인시켜 줍니다. 핵 이상의 가장 높은 비율은 SHR 및 a 매개 knockdown에 의해 ACF one 수준이 감소한 E four or four 발현 세포에서 관찰되었으며, 이는 ACF one knockdown이 E four or four에 의한 세포 사멸을 강화하여 세포 내 E four or four 독성을 증진시켰음을 나타냅니다.

Western blot에서 확인된 바와 같이, 낮은 수준의 ACF1 발현은 E4 또는 4 수준의 증가로 이어지지 않았습니다. 이 절차를 수행할 때, DPI를 사용하여 apoptotic 핵의 수를 정확하게 세고, 이러한 핵을 식별하기 위해 엄격한 기준을 적용하는 것이 중요합니다. 이 절차 외에도, DA pse 수행 후 결과의 유효성을 검증하기 위해 clon genic 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

추가적인 의문점을 해결하기 위해 공동 면역침전(co-immunoprecipitation) 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 조사 대상 단백질들 사이에 물리적 상호작용이 존재하는지 여부를 확인할 수 있습니다.