Microcontact 인쇄를 통해 정렬 기능 심근 조직의 생성

다음 실험의 목적은 마이크로 밀착 프린팅을 통해 정렬된 기능성 심근 조직을 생성하는 것입니다. 이는 최초의 마이크로 접촉 프린팅 피브로넥틴을 폴리 디메틸 실록산 기판에 사용함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 이중 형질전환입니다.

배아 줄기 세포주는 in vitro에서 분화되고 형광 활성화 세포 분류를 통해 분리되며, 이를 통해 강하게 심인성 전구 세포의 고도로 정제된 집단을 얻을 수 있습니다. 다음으로, 분리된 심장 전구 세포를 마이크로 특허 PDMS 기질에 파종하여 악성으로 만들고 막대 모양과 같은 심장 근세포를 취합니다. 사실과 면역형광 분석을 기반으로 심장 전구 세포의 성공적인 분리와 등방성 성장을 보여주는 결과가 얻어졌습니다.

등방성 심근 조직을 생성하면 약물 개발 및 발견을 위한 질병 특이적 세포 재검사 개발 가능성을 높임으로써 줄기세포 생물학 및 조직 생명공학 분야의 발전에 도움이 될 수 있습니다. 그리고 심장 재생 의학의 토대를 마련함으로써. 첫 번째 IL 가드, 180 4 폴리 디메틸 알란 엘라스토머를 10 대 1 기반 경화제 비율로 잘 혼합합니다.

기포를 제거하기 위해 건조제를 사용하여 어셈블리의 가스를 제거합니다. PDMS를 20미크론 너비와 20미크론 간격으로 분리된 2미크론 도구 능선이 있는 이전에 제작된 마스터에 붓고 실온에서 건조제에서 2일 동안 경화하여 마이크로 질감의 PDMS 스탬프를 얻습니다. PDMS 스탬프 표면을 플라즈마 클리너로 친수성으로 렌더링한 후.

1 분 동안 70 % 에탄올로 스탬프를 살균하십시오. 생물 안전 캐비닛에서 압축 공기로 빠르게 건조하십시오. 멸균 스탬프 표면을 피브로넥틴 용액으로 덮어 흡수 후 최소 10분 동안 흡수시킵니다.

스탬프에서 피브로넥틴 용액을 털어내고 압축 공기로 빠르게 건조시킵니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 스탬프와 이전에 준비된 PDMS 코팅 유리 커버 슬립 사이에 등각 접촉을 2분 동안 설정하고 단단히 누릅니다. 마이크로 패턴 기판을 증류수로 헹굽니다.

즉시 사용하지 않는 한 섭씨 4도의 증류수에 최대 2주 동안 보관하십시오. 6개의 웰 플레이트를 증류수에 멸균 0.1% 젤라틴으로 코팅하고 섭씨 37도에서 15분 동안 흡수시킵니다.이 시간 동안 원뿔형 튜브에 있는 PBS 50ml에 첨가하여 ahor aliquot에서 마우스 배아 섬유아세포를 준비합니다. 필로폰을 1000RPM으로 5분 동안 원심분리하고 필로폰 배지에 다시 매달아 놓습니다.

배양 시간이 경과하면 여분의 젤라틴을 흡인하고 메스를 웰에 추가합니다. MES가 하루 동안 연결되도록 허용합니다. 원뿔형 튜브 원심분리기에 PBS 50ml에 배아 줄기 세포 또는 ES 세포를 첨가하여 생각 부분 표본에서 배아 줄기 세포 또는 ES 세포를 준비합니다.

ES 셀을 1000RPM으로 5분 동안 투여하고 Resus는 ESC 배지에 현탁시킵니다. 신화를 포함하는 웰에 E ES 세포를 추가하고 융합 ES 세포를 마사지하기 위해 합류점에 도달할 때까지 ESC 배지를 유지합니다. 먼저 ESC 배지를 흡인하고 멸균 PBS로 세포를 한 번 세척합니다.

그런 다음 PBS를 흡인하고 500마이크로리터의 트립을 웰에 추가합니다. 접시를 섭씨 37도에서 3분 30초 동안 배양합니다. TRIPSIN 용액을 여러 번 위아래로 피펫팅합니다.

먼저 E es 세포 군체를 분해합니다. 그런 다음 웰에 500마이크로리터의 ESC 배지를 첨가하여 트립신 용액을 중화합니다. 필요한 비율에 따라 ES 세포를 마사지하십시오 : 여기에서 E ES 세포는 1 대 30의 비율로 통로를 통해 3 일 이내에 합류점에 도달 할 수 있습니다.

ES 세포가 합류점에 도달했을 때 시험관 내 분화를 시작합니다. 먼저 10cm 배양 접시에 증류수에 멸균 0.1 % 젤라틴을 바르고 섭씨 37도에서 15 분 동안 흡수시킵니다. 이 기간 동안 이전과 같이 ES 세포를 수확합니다.

15분이 경과하면 여분의 젤라틴을 흡입하고 E ES 세포 현탁액의 약 1/3에서 절반을 적응 배지가 포함된 배양 접시에 추가합니다. 적응 배지에서 세포를 2일 동안 배양한 후, 1.5ml의 트립신을 사용하여 PBS가 포함된 50ml 원추형 튜브로 적응된 ES 세포를 수확합니다. 1000RPM에서 5분 동안 원심분리하고 분화 매체에 다시 매달아 놓습니다.

15cm 배양 접시에서 분화 배지 10마이크로리터 방울당 약 1000개의 세포로 구성된 배아체 또는 EBS를 만듭니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 플레이트와 배양을 뒤집습니다. EBS는 섭씨 37도에서 이틀 반 동안 비말을 매달아 놓는다.

이틀 반 후, 분화 배지를 사용하여 15cm 접시 6개에서 8개까지 EBS를 하나로 끌어당겨 3일 반 동안 더 배양합니다. 3일 반이 더 지난 후 EBS를 50ml 원뿔형 튜브에 넣고 멸균 PBS로 플레이트를 한 번 세척하여 모든 EBS를 수집합니다. 그런 다음 약 5분 동안 바닥에 가라앉힙니다.

그런 다음 supinate를 제거하고 멸균 PBS로 EBS를 세척하십시오. EBS를 약 5분 동안 다시 바닥으로 가라앉힙니다. 트립신 2.5ml를 첨가하여 EBS를 분리하고 섭씨 37도의 수조에서 2분 동안 튜브를 부드럽게 흔듭니다.

그런 다음 2.5ml의 멸균 PBS를 트립신 용액에 넣고 10ml의 혈청학적 피펫으로 약 8-10회 위아래로 피펫팅하여 세포 클러스터를 분해합니다. 7.5%E ES 셀 또는 분화 등급 FBS와 0.01%DPI를 함유한 10ml의 팩스 버퍼로 트립신을 중화하고 PBS 원심분리기에서 5분 동안 1000RPM으로 EBS를 해리합니다. 그런 다음 supinate를 제거하고 약 1ml의 팩스 버퍼 피펫을 1ml 피펫으로 위아래로 약 8-10회 추가하여 세포 클러스터를 분해합니다.

세포를 35미크론 세포 스트레이너가 있는 멸균된 둥근 바닥 튜브로 옮겨 단일 세포 현탁액을 얻습니다. aria 유세포 분석기를 사용하여 분화된 ES 세포를 분류하고 committed ventricular progenitor의 정제된 집단을 얻습니다. 자세한 게이팅 전략에 대해서는 프로토콜의 텍스트 부분을 참조하십시오.

마이크로 패턴 기판을 증류수에 1% Onic F1 27로 10분 동안 먹었습니다. 그런 다음 멸균 PBS로 세 번 씻으십시오. 패턴 영역 주위에 PDMS 개스킷을 부착하고 단단히 누릅니다.

그런 다음 심장 전구 세포를 피브로넥틴 마이크로 패턴 기질에 파종합니다. 다음 이미지는 in vitro 분화된 ES 세포 6일차의 대표적인 유세포 분석 차트에서 발췌한 것입니다. 이 이미지는 전방 산란 진폭 FSCA 및 측면 산란 진폭 SSCA에 대한 게이팅을 보여줍니다.

이를 통해 세포 파편에서 전체 세포를 분리할 수 있습니다. 여기서는 FSCA 및 전방 산란 폭 FSCW에 대한 게이팅이 보입니다. 이를 통해 이중항 및 기타 세포 응집체에서 세포 싱글릿을 분리할 수 있습니다.

이 이미지는 SSCA의 게이팅과 SSCW의 산란을 보여줍니다. 이것은 세포 singlet의 순도를 증가시킵니다. 이 이미지는 생존 가능한 DPI 음성 세포와 생존 가능한 세포를 분리할 수 있는 FSCA 및 DPI 염색에 대한 게이팅을 보여줍니다.

여기서 DI 7 PE SI 7의 피코, 린, PE 및 PE 시안색에 대한 게이팅을 볼 수 있습니다. 이를 통해 진적색 양성 및 진적색 음성 세포를 얻을 수 있고 자가형광 적색 음성 세포를 배제할 수 있습니다. 이 이미지는 적색 양성 및 적색 음성 집단 내의 진녹색 양성 및 참녹색 음성 세포를 분류할 수 있는 플루오레세인 이소티오시아네이트 진폭 핏 CA 및 PEA에 대한 게이팅을 보여줍니다.

in vitro 분화된 ES 세포의 Fax 정제는 이 유세포 분석 플롯에서 볼 수 있듯이 4개의 뚜렷한 전구 세포 집단을 나타냅니다. 전구 세포의 4가지 뚜렷한 집단은 빨간색, 양성 녹색, 양성 빨간색, 음성 녹색 양성 및 빨간색 음성 녹색 음성입니다. 이 대표적인 면역형광 현미경 이미지는 마이크로 패턴화된 피브로넥틴 기질을 보여줍니다.

눈금 막대는 80미크론을 나타냅니다. 이 이미지는 배아 유래 사실의 대표적인 면역형광 현미경 검사, 상단 패널의 분리된 전구 세포 및 ESL 유래 사실, 파란색으로 염색된 피브로넥틴 미세 패턴에서 5일 동안 추가로 배양한 후 하단 패널의 분리된 전구 세포를 보여줍니다. S-M-M-H-C-A 염색 된 빨간색 육종 알파 악티닌은 녹색으로 나타납니다.

눈금 막대는 40미크론입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 심장 단백질의 재생 가능한 세포 공급원에서 이방성 기능성 심근 조직을 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.