앞으로 유전 접근 클라미디아의 trachomatis

이 절차의 전반적인 목표는 화학적 돌연변이 유발을 수행하고 유전자형 표현형 연관성을 결정하여 클라미디아 트리투스에 대한 유전자 분석을 수행하는 것입니다. 이는 화학적 돌연변이 유발을 사용하여 클라미디아 트라콤 돌연변이 균주를 먼저 생성함으로써 달성됩니다. 다음으로, 화학적으로 생성된 모든 돌연변이는 전체 게놈 염기서열분석(whole genome sequencing)에 의해 식별된 후 참조 유도 게놈 조립(reference guided genome assembly)에 의해 확인됩니다.

그런 다음 돌연변이 균주에서 표현형 유전자형 연관성이 확인됩니다. 마지막으로, 표현형 유전자형 연관성은 재조합 균주를 생성하고 분석하여 확인합니다. 궁극적으로, 특정 클라미디아 유전자의 돌연변이가 고전적인 화학적 돌연변이 유발 접근법과 차세대 Singh의 조합을 통해 관심 표현형으로 이어진다는 결과를 얻을 수 있습니다.

현재 클라미디아에서 유전자 대체에 사용할 수 있는 방법은 없으며 연구를 위한 분자 유전 도구는 초기 단계에 있습니다. 이 방법은 재조합 DNA를 이용한 형질전환이나 분자 유전 도구의 개발을 필요로 하지 않으면서도 동일한 목표를 달성합니다. 그것은 개별 유전자 산물에 대한 기능의 할당입니다.

배양된 세포를 준비하기 위해, 10%FBS가 보충된 3밀리리터의 DMEM에 25cm 제곱미터당 6개의 vir 세포 중 약 10개를 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 배양합니다. 약 24시간 후 세포가 con fluency에 도달하면 배지를 흡인하고 5의 감염 다중으로 세포를 클라미디아로 감염시킵니다. 감염 후 18시간 후에 화학적 후드 아래에서 돌연변이 유발을 시작하기 위해 시클로헥시미드 1밀리리터당 200나노그램이 포함된 D-M-E-M-F-B-S 총 3밀리리터에서 염화칼슘 및 염화마그네슘과 함께 PBS의 에틸 메탄 설포네이트 또는 EMS 밀리리터당 20밀리그램을 준비합니다.

EMS는 강력한 돌연변이 유발 물질이자 발암 물질입니다. 따라서 폐기에 대해서는 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. Vero 세포에서 배지를 흡인하고 염화마그네슘과 염화칼슘이 함유된 PBS 3밀리리터로 한 번 세척합니다.

그런 다음 3ml의 EMS 용액을 넣고 실온의 흄 후드에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 EMS를 제거하고 돌연변이 유발 물질을 비활성화하기 위해 1몰 수산화나트륨 용기에 넣은 후 세포를 세 번 세척하여 잔류 EMS를 제거합니다. 그런 다음 6 밀리리터의 DMEM 10 % FBS에서 사이클로 하이드 밀리리터 당 200 나노 그램과 겐타 마이신 밀리리터 당 25 마이크로 그램을 넣고 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소로 48-72 시간 동안 배양합니다.

내포물은 72시간에 돌연변이 유발 후 약 36시간 후에 박테리아가 없는 것으로 나타납니다. 내포물의 약 10%는 박테리아로 채워지고 나머지는 비어 있어 초소체 또는 EBS를 추출하여 저장성 용해에 의해 배지를 완전히 흡인합니다. 물 1ml를 넣고 10분 동안 암석을 떨어뜨려 세포를 제거하고 최소 10회 위아래로 피펫팅하여 세포를 용해합니다.

마이크로 fuge 튜브에 용해물을 모은 후 0.25ml의 5 x 자당, 인산염 글루타메이트 완충액 또는 SPG를 1 x 최종 농도에 첨가하고 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 6개의 웰 플레이트에 6개의 세포 중 10개를 약 0.4배 파종하여 웰당 3밀리리터의 DMEM 10%FBS를 파종하여 세포가 다음 24시간 동안 균일한 단층을 형성할 수 있도록 합니다. 다음 가을에는 돌연변이 유발 물질인 클라미디아의 원액인 얼음 위에 떨어집니다.

그런 다음 DMEM 10%FBS에서 희석당 총 200마이크로리터의 10배 연속 희석 튜브 6개를 준비하고 얼음 위에 놓습니다. PBS 웰당 3밀리리터를 사용하여 Vero 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음 6개의 웰 플레이트와 100마이크로리터의 박테리아 희석액을 복제하기 위해 각 웰에 3밀리리터의 DMEM을 추가합니다.

균일한 혼합물을 보장하기 위해 접시를 소용돌이칩니다. 감염된 플레이트를 섭씨 2도에서 700GS로 30분 동안 15°C로 돌립니다. 그런 다음 섭씨 37도의 가습된 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 1-2시간 동안 배양합니다.

그 동안 먼저 다음 성분을 조합하고 혼합하여 DMEM에서 0.54%AROS를 준비합니다. 그런 다음 18.9 밀리리터의 뜨거운 멸균 물, 1.2 % aros를 물에 섞어 뭉침을 방지합니다. 혼합물을 섭씨 55도의 수조에서 따뜻하게 유지하십시오.

접시에서 박테리아 현탁액을 흡인하고 따뜻한 아로 용액 6ml를 추가합니다. 후드 외부의 실온에서 완전히 응고되도록 하십시오. 그런 다음 뚜껑을 제거한 상태에서 생물 안전 후드에서 플레이트가 마르면 플레이트를 추가로 15분 동안 건조시키고 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 7-10일 동안 배양합니다.

플라크는 돌연변이를 분리하기 하루 전에 해부 현미경의 도움으로 볼 수 있어야 합니다. 웰당 100마이크로리터에 있는 4개의 0 셀까지 10을 한 번 봅니다. 96웰 플레이트에서 세포는 24시간 이내에 합류합니다.

해부 현미경으로 채취할 플라크를 표시한 다음 멸균 1ml 차단 피펫을 사용하여 플라크 플러그를 수집합니다. Resus는 10%FBS가 100마이크로리터에 400나노그램/밀리리터, 사이클로, 하이드 및 밀리리터당 50마이크로그램으로 보충된 DMEM 100마이크로리터에 플라크를 현탁시킵니다. Gentamicin을 투여하여 돌연변이 균주를 확장하고, 현탁액을 Vero 세포의 합류 단층에 오버레이합니다.

의 50% 이상이 감염되었을 때 수확 dbs를 배양하기 전에 2, 700GS 및 섭씨 15도에서 30분 동안 플레이트를 회전시키며, 이는 감염 후 빠르면 48시간에서 늦어도 14일까지 발생할 수 있습니다. 이 정도의 감염된 세포는 감염된 세포의 긴장저하 용해를 통해 EV를 추출할 수 있을 만큼 충분한 생존 가능한 박테리아를 저장할 수 있습니다. 160마이크로리터의 멸균수에서 배지를 흡입한 후 실온에서 10분 동안 배양합니다.

배리어 팁을 사용하여 위아래로 여러 번 피펫팅하여 세포를 파괴하여 완전한 용해를 보장합니다. 마지막으로 각 용해물 160마이크로리터를 마이크로 퍼지 튜브로 옮깁니다. 40마이크로리터의 5개의 XSPG를 넣고 섭씨 영하 80도에서 돌연변이를 분석하고 관심 표현형을 스크리닝할 준비가 될 때까지 보관합니다.

돌연변이 유발 물질에 노출되면 박테리아가 없는 것처럼 보이는 내포물이 발생하는데, 이는 박테리아 세포의 사멸로 인한 것으로 추정됩니다. 일반적으로 혈청형 LGVL 2는 감염 후 48시간 이내에 감염된 세포를 완전히 제거하지만, 돌연변이 유발 물질로 치료하면 이 주기가 90시간 이상으로 연장될 수 있으며, 본 실험에서 약 10%의 내포물이 회복될 것으로 예상됩니다. 이 그림에서 볼 수 있듯이 EMS 1밀리리터당 20mg을 투여한 감염된 베로 세포는 치료되지 않은 대조군에 비해 감염성 자손의 회복율이 99% 감소했습니다.

돌연변이원 치료는 또한 작은 플라크를 포함하여 형태가 변경된 플라크의 출현으로 이어졌습니다. 다른 형태학에는 여기에 표시된 것처럼 과립형, 덩어리 모양 또는 벌집 모양으로 보이는 플라크가 포함됩니다. 이러한 연구에 사용된 EMS의 용량은 NGS에 의해 실험적으로 평가된 바와 같이 KCL 게놈당 3개에서 30개 사이의 돌연변이를 유발할 수 있습니다.

gradient purified EBS에는 숙주 세포 물질이 거의 없지만 숙주 DNA도 검출되며 이 절차에 따라 약 10-15%의 게놈 프렙을 구성합니다. 조직 배양 세포의 복제 장애, 생화학적 활성의 상실 또는 박테리아 형태 변경과 같은 표현형에 대한 스크리닝을 수행하여 클라미디아의 형성 및 유지에 필요한 박테리아 인자, 병원성 인자와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.