해부 및 제브라 피쉬 배아의 측면 장착 : 척수 개발의 분석

이 절차의 전반적인 목표는 척수의 최적 현미경 시각화를 위해 제브라피시 배아를 해부하고 장착하는 것입니다. 이것은 먼저 마이크로가 오크 볼을 해부하고 제거함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 참나무 파편을 제거하고 배아를 슬라이드에 피펫

다음으로, 여분의 액체를 Kim wipe로 조심스럽게 제거한 다음 장착 매체를 추가합니다. 마지막 단계는 배아 포커로 배아를 슬라이드의 방향을 잡은 다음 커버 슬립을 적용하는 것입니다. 궁극적으로 형광 또는 명시야 현미경은 유사분열 후 세포체의 분포와 발달 중인 축삭돌기의 궤적을 보여주는 데 사용됩니다.

이 방법은 패터닝, 분화 및 축삭 유도를 담당하는 메커니즘이 무엇인지와 같은 신경 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 신경계 발달의 여러 측면에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 근육 발달과 같은 다른 조직에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 실험을 시작하기 전에 현미경으로 해부해야 하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

피펫 팁을 과거 피펫에 붙인 다음 낚싯줄을 피펫 팁에 붙여서 배아 포커를 만듭니다. 배아 해부를 시작하려면 최대 30개의 제브라피시 배아를 배치합니다. PBS로 채워진 35mm 페트리 접시에 수정 후 24 시간.

해부 현미경으로 집게로 배아의 머리를 고정하고 곤충 핀으로 참나무를 잡아당깁니다. 그런 다음 배아 포커를 사용하여 배아를 노른자 파편이 많지 않은 페트리 접시의 일부로 이동합니다. 다음으로, 배아를 유리 목초지 피펫에 흡인하여 가능한 한 적은 액체를 끌어올립니다.

그런 다음 최대 21개의 배아를 슬라이드에 부드럽게 피펫으로 주입합니다. 배아를 만지지 않고 실험실 물티슈를 사용하여 여분의 액체를 조심스럽게 흡수한 다음 배아에 장착 매체 한 방울을 추가합니다. 다음으로, 배아 포커를 사용하여 배아를 2-3줄로 옆으로 향하게 합니다.

이제 커버 슬립의 각 모서리에 바셀린을 약간 추가합니다. 바셀린이 있는 면이 아래를 향하도록 커버 슬립을 돌리고 커버 슬립을 배아 위에 놓습니다. 바셀린은 과도한 압박으로 인한 배아 손상을 방지하는 역할을 합니다.

필요한 경우 20-100 마이크로 리터 범위의 피펫을 사용하여 장착 매체가 커버 슬립에 닿을 때까지 각 모서리의 커버 슬립을 부드럽게 두드립니다. 커버 슬립 옆에 더 많은 장착 미디어를 추가하고 추가된 미디어가 커버 슬립 아래로 심지가 되도록 합니다. 이제 실험실용 물티슈를 사용하여 커버 슬립 주변을 완전히 청소하십시오.

커버 슬립에 압력을 가하면 적절하게 청소할 때 배아가 손상될 수 있고 해당 영역이 건조하며 바셀린이나 장착 매체가 없으므로 압력을 가하지 마십시오. 매니큐어를 사용하여 커버 슬립의 가장자리를 밀봉하여 마무리합니다. 제브라피시 배아를 장착한 후, 참나무 주머니 확장 위의 여러 HEMI 세그먼트가 시각화되었습니다.

이 그림은 제브라피시 배아의 배쪽 척수에서 NK X 6.1 발현을 보여줍니다. NK X 6.1 mRNA는 수정 후 24시간이 지나면 척수의 대략 복부 절반에 분포합니다. 전구 도메인 내에서 전구 세포는 척수의 내측 부분에서 발견되는 바닥 판의 존재로 인해 유사 분열 후 세포와 구별 할 수 있습니다.

DIC 광학 장치로 본 결과입니다. 개별 세포는 명확하게 구별할 수 있으며 발현 세포와 발현하지 않는 세포 사이의 정의된 경계가 분명합니다. 전구 세포주기 종료는 유전자 발현의 변화를 동반합니다.

이 이미지는 유사분열 후 뉴런에서 로보 3 발현을 보여줍니다. 수용체의 로보 계열은 축삭 유도 수용체(axon guidance receptor)로, 이 수용체의 발현은 유사분열 후 뉴런의 정확한 수를 허용합니다. 바닥판과 전구 영역은 이 더 많은 측면 초점면에서 분명하지 않습니다.

컨포칼 현미경 검사는 znp one immunofluorescence를 이미지화하는 데 사용되었으며, 이는 이 측면에 장착된 배아에서 볼 수 있듯이 운동 축삭을 표시합니다. 운동 뉴런은 수정 후 24시간이 지나면 척수 복부를 통해 나와 주변의 발달 중인 근육 조직에 신경을 공급합니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 30분 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 신중한 현미해부를 통해 조직의 무결성을 보존해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 장착 및 현미경 시각화를 위해 제브라피시 배아의 노른자를 제거하기 위해 현미해부 기술을 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.