C 형 간염 바이러스의 복제를 분석하기위한 프로토콜

본 실험 절차의 전반적인 목적은 C형 간염 바이러스(HCV) 복제 주기의 다양한 단계를 조사하는 것입니다. 이를 위해 먼저 선형화된 HCV 플라스미드 구조체로부터 HCV 게놈 RNA 전사체를 생성합니다. 두 번째 단계는 세포에 HCV RNA를 형질전환시키는 것입니다. 다음으로, 다양한 시간대와 분석을 위해 세포를 플레이트에 분주합니다. 마지막 단계로, 바이러스 역가 측정을 위해 세포 배양 상층액을 수집하고, 단백질 및 RNA 분석을 위해 형질전환된 세포를 회수합니다. 최종적으로 역전사 PCR, 웨스턴 블로팅, 면역형광 분석 및 HCV 역가 측정을 수행하여 강력한 HCV 감염 세포 배양 시스템을 입증합니다.

이 감염성 C형 간염 바이러스(HCV) 세포 배양 시스템의 HCV 레플리콘 시스템 대비 주요 장점은 바이러스의 침입, 비리온 조립 및 방출 단계를 연구할 수 있다는 점입니다. 이 프로토콜은 비리온 형태 형성 및 숙주-병원체 상호작용과 같이 C형 간염 바이러스학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 잠재적인 백신 후보로 평가될 수 있는 약독화된 바이러스 균주의 특성을 분석할 수 있게 함으로써 백신 개발로까지 응용 범위가 확장됩니다.

이 방법은 C형 간염 바이러스에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, Flaviviridae 과의 다른 RNA 바이러스에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 고품질의 HCV 게놈 RNA를 생성하는 데 어려움을 겪게 됩니다. genotype-2A HCV 일본인 전격성 간염 1 분리주의 발견 이후, 세포 배양을 통해 HCV의 전체 복제 주기를 연구하는 것이 가능해졌습니다. 바이러스학적 분석은 분자 생물학적 기술과 세포 생물학적 기술 모두에 대한 전문 지식이 필요하므로, 이에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.

바이러스 복제 평가를 위해 유전자형 내 2A 키메라 바이러스인 F-N-X-H-C-V 및 pol-null HCV를 사용하며, 2mL 튜브에서 XBA-one 제한 효소로 처리하여 이전에 생성된 바이러스 플라스미드를 선형화합니다. 그런 다음 플라스미드를 mung bean nuclease로 처리하여 평활 말단을 생성합니다.

음이온 교환 크로마토그래피를 통해 절단된 플라스미드를 정제하십시오. 아가로스 겔 전기영동을 통해 선형화된 플라스미드의 무결성을 확인하십시오. 다음으로, HCV 게놈 RNA 전사체를 합성하기 위해 T-seven RNA 중합효소 반응 성분이 포함된 0.2 milliliter 튜브에 선형화된 플라스미드 DNA 템플릿을 첨가하십시오.

RNA 정제 키트를 사용하여 새로 합성된 DNase 처리 RNA를 정제하십시오. 그 다음, 아가로스 겔 전기영동을 통해 RNA 생산을 확인하십시오. 이어서, 분광 광도법으로 RNA 양을 정량하십시오.

트립신 효소 처리를 통해 Huh-7 기반 부착 세포를 떼어내고, 50 mL 코니컬 튜브에 수집합니다. 두 차례의 원심분리 후, 세포 펠렛을 차가운 저혈청 배지로 재현탁합니다. 원심분리를 반복한 후, 세포를 1 × 10⁷ cells/mL 농도의 저혈청 배지로 재현탁합니다.

다음으로, 전사된 바이러스 RNA 총 10 µg과 재현탁된 세포 400 µL를 미리 냉각시킨 0.4 cm 전기천공 큐벳에 혼합합니다. 270 V, 100 Ω, 950 µF 조건에서 전기천공을 통해 바이러스 RNA를 세포 내로 전달합니다. 완료 후, 전기천공된 세포를 15% FBS가 포함된 10 mL의 완전 성장 배지에 재현탁합니다. 이 시점에서, 4, 48, 96시간 시점의 분석을 위해 T 25 플라스크에는 플라스크당 약 1.2 × 10⁶ cells, 48웰 플레이트에는 웰당 1 × 10⁴ cells의 밀도로 세포를 분주합니다. transfection 후 4~8시간 후에, 배양 중인 플라스크와 플레이트에서 사멸한 세포 잔해를 제거하기 위해 10% FBS가 첨가된 신선한 성장 배지로 교체합니다.

세롤로지컬 피펫을 사용하여 48시간 및 96시간 시점에서 세포 배양 상층액을 15 milliliter 원심분리관에 수집합니다. 그다음, 4 degrees Celsius에서 10분 동안 15,000 rpm으로 원심분리하여 수집된 샘플에서 세포 잔해를 제거합니다. 원심분리 후, 세포가 제거된 상층액을 negative 80 degrees Celsius에서 보관합니다.

지정된 시점에 western blot 및 역전사 정량 PCR(RT-qPCR)을 통한 단백질 및 RNA 분석을 위해 세포를 용해합니다. 0.2 mL 튜브에서 역전사 효소와 5' 비번역 부위에 결합하는 HCV sense strand 특이적 프라이머를 사용하여 1 µg의 총 세포 RNA를 역전사합니다. 또한, HCV sense strand 프라이머를 사용하여 게놈 카피 수가 알려진 F-N-X-H-C-V-R-N-A를 역전사합니다. real-time PCR 시스템을 사용하여, 특정 HCV 프라이머와 DNA 결합 green dye가 포함된 qPCR super mix를 이용해 결과물인 cDNA 50 ng으로 qPCR을 수행합니다. H-C-V-R-N-A 카피 수를 결정하기 위해 qPCR을 실행할 때 다음 조건을 사용하십시오. qPCR 이후, 바이러스 RNA가 전이된 지 96시간 후에 세포 용해물을 SDS page로 분리합니다. 그런 다음 겔에서 분리된 단백질을 trans-blot turbo 방법으로 polyvinylidene difluoride 막으로 전이합니다. PBS 내 5% skim milk와 0.2% tween-20이 포함된 블로킹 용액을 사용하여 막을 블로킹하고 용기에 넣습니다.

4°C 저온실에서 1:1,000로 희석한 마우스 단클론 1차 항체 NS3와 1:5,000로 희석한 beta-actin으로 멤브레인을 반응시킵니다. 반응 후, 1:5,000로 희석한 horseradish peroxidase 결합 goat anti mouse immunoglobulin-G를 첨가하고 화학발광법으로 검출합니다.

이 단계에서, 면역형광 분석을 위해 HCV RNA가 transfection된 세포를 메탄올을 사용하여 -20 °C에서 30분 동안 고정합니다. 완료 후, PBS로 세포를 3회 세척합니다. 면역형광 분석 블로킹 버퍼로 블로킹한 후, rabbit polyclonal anti-NS5A 1차 항체와 mouse monoclonal anti-dsRNA 항체 J2를 1:200으로 희석하여 사용하고 4 °C 냉장실에서 5시간에서 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 후, 1차 항체 처리 단계에 이어 PBS로 세포를 3회 세척합니다. 그다음 goat anti-rabbit immunoglobulin-G 488 polyclonal 2차 항체와 goat anti-mouse immunoglobulin 594 polyclonal 2차 항체를 1:1000으로 희석하여 첨가하고, 테이블탑 로커 위에서 상온으로 1시간 동안 배양합니다. PBS로 세포를 3회 세척한 후, Hoechst 염색약으로 핵을 염색하고 형광 현미경으로 관찰합니다.

다음으로, 96-well 플레이트를 사용하여 naive Huh7.5.1 세포를 well당 약 3 × 10³ cells로 분주합니다. 다음 날, 성장 배지를 사용하여 HCV RNA가 transfection된 세포에서 수확한 무세포 배양 상청액을 10배 단계 희석하고, 이를 Huh7.5.1 세포에 3반복으로 접종합니다. 감염 72시간 후, -20 °C에서 메탄올을 사용하여 30분 동안 세포를 고정합니다. 냉동고에서 세포를 꺼낸 후, 이전에 설명한 조건으로 HCV NS5A 단백질에 대해 면역 염색을 수행합니다. 형광 현미경을 사용하여 바이러스 희석 배수가 가장 높은 well에서 NS5A 양성 세포 foci를 측정하고, ml당 평균 focus forming unit 수를 계산합니다.

선형화된 HCV 플라스미드의 품질을 겔 전기영동으로 평가하였습니다. H-C-V-D-N-A를 T-seven RNA polymerase 매개 인비트로(in vitro) 전사에 사용하였으며, 그 결과 9.6 Kilobases 크기의 단일 RNA 산물이 생성되었습니다. RT-qPCR 결과, 야생형 바이러스는 게놈을 효율적으로 복제하는 것으로 나타났습니다. 야생형은 pol-null 바이러스와 비교하여 게놈 복제 수준이 1~3 log 더 높게 나타났습니다.

야생형 바이러스는 바이러스 단백질 절단 및 게놈 복제에 관여하는 NS3 단백질을 생성했습니다. 또한 야생형 바이러스는 NS5A 단백질을 발현했으며, 야생형이 형질전환된 세포의 세포질 내에서 NS5A 단백질과 이중 가닥 RNA가 공국소화(co-localized)되어 활발한 바이러스 복제가 일어나고 있음을 시사했습니다. 바이러스 역가 측정 결과, 야생형 바이러스는 감염력이 있으며 감염성 입자 mL당 10,000 FFU 이상의 초점 형성 단위를 생성하는 것으로 나타났습니다. 형질전환 6시간 후, 야생형과 pol-null 바이러스는 유사한 루시페라아제 활성을 보였으며, 이는 형질전환된 RNA의 유입 수준이 비슷하게 번역되었음을 나타냅니다. 그러나 형질전환 48시간 및 96시간 후, 야생형 바이러스는 pol-null 바이러스에 비해 증가된 게놈 복제 수준을 보였습니다. 야생형 바이러스는 또한 바이러스 NS3 단백질을 생성했습니다. pol-null 바이러스는 기저 수준의 루시페라아제 활성을 보인 반면, 야생형 바이러스는 pol-null 리포터 바이러스에 비해 복제 수준이 2~3 log 더 높았습니다. C형 간염 바이러스(HCV) 바이러스학적 분석법을 숙달하면, 적절하게 수행할 경우 2주 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 건강한 세포와 고품질의 HCV 게놈 RNA 전사체를 확보하는 것이 중요합니다. 본 절차를 통해 특성이 규명된 HCV 균주를 동물 모델 시스템에서 테스트하여 생체 내 적응도와 호스트-병원체 상호작용을 조사할 수 있습니다.

감염성 HCV 세포 배양 시스템의 개발은 연구자들이 HCV 복제 주기의 비리온 형태 형성 및 바이러스 방출 단계를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 C형 간염 바이러스 복제 주기의 각 단계를 특성화하기 위한 다양한 바이러스 분석법을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. C형 간염 바이러스 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안 적절한 개인 보호 장구 착용과 같은 안전 예방 조치를 항상 준수해야 함을 잊지 마십시오.