박층 크로마토 그래피 (T​​LC) 분판 및 식물 추출물의 생물학적 검정법은 항균 화합물을 확인하는

이 절차의 전반적인 목표는 혐기성 박테리아에 항균 작용을 하는 식물 대사 산물을 식별하는 것입니다. 이는 먼저 박층 크로마토그래피 또는 TLC로 식물 추출물을 분리함으로써 이루어집니다. 다음으로, 크로마토그램을 하나 이상의 화합물을 포함하는 구역으로 절단합니다.

그런 다음 구역을 한천에 놓고 혐기성 박테리아를 접종하고 배양합니다. 배양 후 영역을 제거하고 플레이트를 염색하여 박테리아 성장을 억제하는 화합물을 식별합니다. 결과 데이터는 항균 식물 대사 산물의 존재 또는 부재를 보여줍니다.

이 방법은 특정 미생물의 영양소 이용에 대한 식물 2차 대사 산물의 영향과 같은 반추 동물 영양 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 반추위 박테리아를 억제하는 식물 화합물을 드러냅니다. 또한 다른 박테리아나 곰팡이를 억제하는 화합물을 밝히는 데 적용할 수도 있습니다.

이 프로토콜에서는 레드 클로버의 페놀 화합물을 사용하여 접촉 전기에 의한 항균 화합물의 식별을 입증합니다. 흄 후드에서 작동하는 박층 크로마토그래피 또는 TLC 플레이트를 청소하는 것으로 시작하십시오. TLC 현상 챔버의 바닥과 TLC 플레이트의 하단 가장자리를 덮을 수 있도록 충분한 세척 용매를 준비합니다.

여기 챔버 내부에 설정하면, 에틸 아세테이트 메탄올 2 대 1이 제조된다. 다음으로, 장갑을 끼고 흄 후드에서 작업합니다. 가위를 사용하여 알루미늄 또는 플라스틱으로 뒷받침된 유연한 실리카 플레이트를 현상 챔버에 맞게 절단합니다.

상단이 챔버 벽에 기대어 있도록 플레이트를 챔버에 삽입합니다. 접시가 서로 닿지 않아야 합니다. 챔버를 덮고 용매가 모세관 작용에 의해 플레이트 위로 이동하도록합니다.

용매가 플레이트 상단에 도달하면 챔버에서 용매를 제거하고 용매가 증발할 때까지 흄 후드의 서 있는 위치에 배열합니다. 플레이트가 건조되면 TLC 플레이트 상단 근처로 불순물이 이동했는지 확인합니다. 이들은 가시 광선 아래에서 노란색 띠 또는 자외선 아래에서 형광 띠로 나타납니다.

플레이트의 대부분이 여전히 황색을 띠면 동일한 용매를 사용하여 동일한 TLC 챔버에서 세척 과정을 반복합니다. 챔버에서 TLC 플레이트를 제거한 후 용매를 폐기합니다. 프로토콜의 다음 부분에 챔버를 사용하기 전에 잔류 용매가 완전히 증발하도록 합니다.

다음으로, 실리카 소품에서 화합물의 이동에 영향을 줄 수 있는 잔류 수분을 제거하기 위해 플레이트를 섭씨 100도의 건조 오븐에서 10-15분 동안, 20 x 20cm 플레이트의 경우 5분, 7 x 10cm 플레이트의 경우 5분 동안 플레이트를 똑바로 세웁니다. 플레이트가 건조되면 추출물을 넣기 전에 주변 온도로 식히십시오. 추출물 분리를 위해 챔버를 준비하려면 가위를 사용하여 챔버 높이보다 약간 낮고 챔버 둘레 너비의 약 절반을 절단합니다.

이 종이는 챔버 벽 위로 용매를 끌어올리고 챔버를 용매 종이로 포화시키는 심지 역할을 하여 분리의 재현성을 향상시킵니다. 흄 후드에서 여기에 용매를 혼합합니다. 사용되는 용매는 에틸 아세테이트 메탄올, 부피 당 4 대 1 부피입니다. 용매 혼합물을 챔버에 붓고 덮습니다.

연필을 사용하여 챔버의 현상 용매 표면 위에 있는 TLC 플레이트의 한 지점에서 원점을 가볍게 표시합니다. TLC 플레이트 흡수제가 부드럽고 쉽게 손상되는 경우 그림과 같이 가장자리에 표시를 하십시오. 다음으로, 탁한 현탁액 대신 농축된 용액을 갖도록 충분한 유기 용매에 추출물을 용해시킵니다.

여기서 사용되는 용매는 메탄올입니다. 모세관 마이크로 피펫 또는 마이크로리터 주사기를 사용하면 플레이트 측면에 1cm 테두리를 남기고 표준물질과 샘플을 좁은 밴드로 로드하고, 플레이트를 건조시키거나, 플레이트를 부채질하거나, 흄 후드에 로드하면 밴드를 더 빨리 건조시키는 데 도움이 됩니다. 밴드가 건조되면 같은 지점 또는 그 위에 샘플을 다시 로드합니다.

플레이트에 더 높은 농도의 샘플이 필요한 경우 TLC 챔버에서 필요에 따라 반복합니다. 전체 심지가 용제로 포화되었는지 확인하십시오. 그런 다음 집게나 집게를 사용하여 플레이트를 TLC 챔버 내부에 놓습니다.

접시가 심지에 닿지 않아야 합니다. 챔버를 덮고 용매 전면이 플레이트 상단에 도달하기 전에 플레이트가 현상되도록 합니다. TLC 탱크에서 플레이트를 제거하고 연필로 솔벤트 전면의 높이를 표시하십시오.

접시를 말리십시오. 흄 후드에서 동일한 TLC 챔버에 남아 있는 TLC 플레이트를 개발하며, 닫아 두면 일반적으로 하루 종일 사용할 수 있습니다. 챔버의 용매 양이 눈에 띄게 감소하면 플레이트가 건조 된 후 더 많은 용매 혼합물을 만드십시오.

가시광선 또는 자외선 아래에서 밴드를 시각화합니다. 휴대용 UV 램프가 있는 관찰 챔버는 특히 램프가 254나노미터 단파 UV와 365나노미터 장파 UV 모두에서 화합물을 감지할 수 있는 경우 편리합니다. 연필을 사용하여 오버헤드, UV 및/또는 가시광선이 장착된 젤 사진 문서화 시스템을 사용하여 밴드를 묘사하면 플레이트의 이미지를 얻을 수 있습니다.

마지막으로, 대역 특성화를 돕기 위해 먼저 화합물에 의해 이동한 거리를 측정한 다음 용매에 의해 이동한 거리를 측정하고 전자를 래더로 나누어 보유 계수 또는 RF 값을 계산합니다. 밴드 위치가 표시되면 나중에 사용할 수 있도록 플레이트를 보관할 수 있습니다. 생물 검정에 사용하십시오.

접시를 플라스틱으로 싸서 호일로 덮으십시오. 접시는 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 최대 보관 시간은 실리카가 중성이 아니기 때문에 화합물 안정성에 따라 달라집니다.

일부 화합물은 TLC 플레이트에 있는 동안 분해될 수 있습니다. contact biography assay를 준비하기 위해 혐기성 조건에서 hyper ammonia producing bacteria 또는 HAB medium을 준비하고 접종합니다. 이 경우에 사용된 배양액은 클로스트리듐 스틱랜드 눈 피로 시니어입니다.

배양물을 섭씨 39도에서 지수 또는 고정상으로 성장시킵니다. 혐기성 미생물로 작업할 때 멸균 혐기성 기술을 사용하십시오. 부피당 0 포인트 75% 중량을 준비합니다.

한천의 온도가 섭씨 60도 미만으로 감소한 후 박테리아를 성장시키는 데 사용되는 동일한 매체의 한천. 용융된 한천에 배양액 당 1%부피를 접종하고 즉시 부드럽게 혼합하여 혐기성 챔버에 넣고 가위로 15 x 100mm 플라스틱 페트리 접시에 붓습니다. TLC 플레이트를 관심 밴드가 포함된 영역으로 자릅니다.

샤피를 사용하여 플레이트의 뒷면을 표시했습니다. 사용하지 않은 TLC 스트립을 한천 플레이트에 대조군으로 놓습니다. 그런 다음 밴드를 뒤집어 한천 플레이트에 놓습니다.

혐기성 챔버에서 한천 쪽이 아래로 향하게 플레이트를 배양합니다. 집게로 섭씨 39도에서 24시간 동안 인큐베이터. 혐기성 챔버에 있는 동안 한천 플레이트에서 TLC 밴드를 제거합니다.

한천 플레이트의 표면에 테트라 발황 붉은색을 적게씩 첨가합니다. 적어도 20분 동안 색상이 발현되도록 합니다. 제어판이 완전히 빨갛게 변하면 혐기성 챔버에서 플레이트를 제거하십시오.

클로스트리듐 스틱 란디는 혐기성 박테리아이므로 혐기성 챔버에서 제거한 직후 생존력을 잃기 시작하지만 색상은 24시간 이상 안정적입니다. 디지털 카메라를 사용하여 충분한 대비를 제공하는 배경에서 가시광선 아래에서 판을 촬영합니다. 살아있는 세포가 염색될 때 밝은 빨간색이 관찰됩니다.

죽은 세포는 얼룩이 지지 않습니다. 대표적인 실리카, 페놀 화합물을 함유한 레드 클로버 추출물의 TLC 분리가 여기에 나와 있습니다. 에틸 아세테이트 헥산을 8.5 센티미터에 걸쳐 9 대 1로 분리하면 5 개의 띠가 생성되며, 그 중 하나는 원점에서 완전히 분리되었습니다.

로드된 표준은 Formin, Bio, Canon A 및 Genine이었습니다. 이 플레이트의 4개 밴드를 24시간 동안 반추위 하이퍼 암모니아인 클로스트리듐 스틱 란디(Clostridium stick Landi)로 배양에 적용하고 여기에 표시된 대로 테트라 올렘 레드(tetra oleum red)로 염색했습니다. 박테리아 파종 한천에 밴드 1 Bio Canon A와 밴드 2 4 Monon nein의 일부를 사용한 배양은 잘 정의 된 억제 영역을 초래했습니다.

그러나 밴드 2의 나머지 부분과 밴드 3 및 4의 배양은 박테리아 성장을 억제하지 않았습니다. 이러한 결과는 바이오 캐논 A는 스틱랜드 안구 성장을 억제하지만 폼 에이원 네인은 그렇지 않다는 것을 보여주었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 이 기술이 유연하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

적절한 배지를 선택하고 분리 화학과 검출 방법이 호환되는지 확인하기 위해 대조군이 포함된 한 다른 테스트 미생물을 사용할 수 있습니다. 이 절차에 따라 고성능 액체 크로마토그래피 및 질량 분석법과 같은 다른 기술을 사용하여 생물학적 분석에서 확인된 항균 화합물을 특성화할 수 있습니다.