인간 혈청에서 작은 비 암호화 RNA를의 분리

이 절차의 전반적인 목표는 혈청 샘플에서 고품질 RNA를 분리하는 것입니다. 일반적인 MRC의 최적화된 버전을 사용하여 시약 RTLS 프로토콜을 사용해 보십시오. 이는 먼저 혈청을 뉴클레아제가 없는 물과 1:5 비율로 희석하여 단백질 오염을 줄임으로써 이루어집니다.

두 번째 단계는 첫 번째 원심분리 단계를 위해 두 개의 밀리리터 위상 고정 튜브를 도입하는 것입니다. 이것은 페놀 및 단백질과 같은 대부분의 오염 물질을 유기 단계에 가둡니다. 다음으로, 세 번째이자 마지막 최적화 단계는 12, 000 치즈에서 플래시 원심분리 스핀으로, 에탄올 세척 전에 RNA 펠릿에서 잔류 오염을 제거합니다.

마지막 단계는 더 높은 총 RNA 수율이 필요한 경우 동일한 환자로부터 두 개의 변형된 RNA 제제를 모으는 것입니다. 궁극적으로 뉴클레아제가 없는 물에 있는 용융화 혈청은 위상 고정 튜브를 사용하여 주요 오염 물질을 포집하고 플래시 스핀을 도입하는 이 변형된 방법을 사용합니다. 우리는 혈청에서 RNA 분리로부터 작은 비코팅 RNA의 회수를 극대화할 수 있음을 보여줍니다.

표준 triol RNA 분리 프로토콜과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 간단한 수정을 통해 혈청에서 RNA의 수율을 극대화할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 혈청에서 작은 RNA가 소량으로 발견되기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이러한 단계의 최적화된 방법과 시각화는 이러한 RNA의 회수를 개선하고 초보자를 성공적인 분리 팁으로 안내합니다.

이전에 준비된 냉동 혈청 샘플을 얼음에서 해동하기 시작한 다음 갓 해동한 혈청 400마이크로리터를 라벨이 부착된 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 혈청을 100마이크로리터의 R nase 자유수로 희석하고 50마이크로리터의 proteinase K를 밀리리터당 1밀리그램의 농도로 첨가합니다. 그런 다음 희석된 혈청을 섭씨 37도에서 20분 동안 배양하여 적절한 단백질 소화가 이루어지도록 하여 1.5ml의 트라이 시약 RTLS 및 100마이크로리터의 4개의 프로모 아놀에서 완전한 용해를 보장합니다.

균질산염을 잠시 뒤집고 5초 동안 반복적인 피펫팅을 수행합니다. 그런 다음 혼합물을 라벨이 붙은 2밀리리터 중상 잠금 튜브로 옮깁니다. 12, 000 GS에 균질산염을 4 섭씨 온도에 20 분 동안 회전시키십시오.

다음으로, 생성된 수용액 1ml를 새로운 DNA 낮은 결합 튜브에 조심스럽게 디캔팅합니다. 유기 및 계면은 위상 고정 튜브의 흰색 젤 아래에 갇혀 있어야 합니다. 그런 다음 5 마이크로 리터의 글리코겐과 500 마이크로 리터의 100 % 이소프로판올을 수용액에 첨가합니다.

용액을 반전으로 혼합하고 섭씨 영하 20도에서 밤새 배양합니다. 하룻밤 배양 후, 섭씨 4도의 원심분리기에서 12, 000 GS에서 20분 동안 샘플을 원심분리합니다. 다음으로, 투명한 상층액을 버리고 섭씨 4도의 원심분리기에서 16, 000GS에서 2분 동안 플래시 스핀을 수행합니다.

피펫을 사용하여 펠릿을 둘러싼 투명한 용액을 조심스럽게 제거합니다. 다음 70%ethanol의 1 밀리리터를 가진 펠릿을 세척하고 10, 10 분 동안 000 GS에 표본을 분리기하십시오. 펠릿을 시각화하려면 어두운 배경 앞에서 튜브를 기울이고 세척 용액을 디캠프합니다.

세탁을 반복합니다. 한 단계 더 나아가세요. 우리는 펠릿을 10 마이크로 리터의 RNA가없는 물에 현탁시킵니다.

샘플을 섭씨 55도에서 5분 동안 가열하여 펠릿이 완전히 용해되었는지 확인합니다. 이 기간 동안 샘플을 반복적인 피펫팅과 혼합하여 동일한 환자의 두 RNA 제제인 총 RNA 수율 풀을 높입니다. UV vs. 분광광도계를 사용하여 재현탁된 RNA를 정량화

하고 2100 바이오분석기를 사용하여 RNA 품질을 평가합니다. 그런 다음 풀링된 RNA 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관하여 다운스트림 응용 분야에 사용합니다. 인간 혈청에서 추출한 RNA의 스펙트럼 측광 프로파일은 전통적인 chum Chomsky 접근법에 여러 단계를 추가함으로써 RNA의 수율이 향상되었음을 보여줍니다.

인간 혈청에서 분리된 RNA의 일반적인 UV 프로파일은 글리코겐 및 추가 스핀 추가를 포함한 최적화 단계를 활용하는 것과 대조를 이루며, 이러한 각 도구가 결합되어 오염 물질이 감소하고 총 RNA 수율이 증가합니다. RNA 샘플의 순도는 페놀과 단백질을 가두는 위상 고정 겔을 사용하여 더욱 증가했습니다. 또한 혈청의 부피를 늘리면 RNA 수율에 현저한 영향을 미칩니다.

샘플의 품질을 추가로 분석하기 위해 바이오분석기 추적을 수행했습니다. 약 21개의 뉴클레오티드에서 단일 스파이크는 마이크로 RNA 분획 어레이 프로파일링을 나타내며 절차에 따라 QPCR을 수행했습니다. 3개의 두경부암과 1개의 정상 S암에 대한 이 어레이 프로파일은 microRNA의 발현을 보여주고, 계층적 클러스터링을 사용하여 분석하며, microRNA의 상향 조절 및 하향 조절을 볼 수 있는 히트 맵으로 제시됩니다.

다음 QPCR 증폭 곡선은 특정 microRNA에 대해 생성되었습니다. 그런 다음 이 데이터를 사용하여 정상 혈청에 대한 원시 CT 값을 표시했습니다. 일단 마스터하면 이 기술은 절차에 따라 적절하게 수행되면 오늘날 최대로 고품질 RNA를 생산하는 여러 환자에 대해 수행할 수 있습니다. 정량적 PCR 또는 차세대 염기서열분석과 같은 다른 방법을 수행하여 바이오마커 발견 및 검증과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.