인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

이 절차의 전반적인 목표는 인간 근육 생검 샘플에서 얻은 두 개의 주요 세포 집단을 높은 효율과 수율로 분리하여 특정 표현형 및 전사 인자 마커를 평가할 수 있도록 하는 것입니다. 이것은 먼저 두 번째 단계에서 인간 근육 생검 샘플을 단일 세포 현탁액으로 해리함으로써 달성됩니다. 7일간의 배양 후, 세포는 근육 세포인 CD 56 양성 분획과 섬유아세포인 CD 56 음성 분획으로 분류되는 면역 자기 비드에 의해 분리됩니다.

그런 다음 세포를 염색하고 원하는 표현형 및 관심 단백질 마커에 대해 이미지화합니다. 궁극적으로, 면역형광 현미경 검사와 정량적 이미지 분석을 사용하여 분류된 세포 집단 내에서 선택된 핵 국소 전사 인자의 강도를 측정할 수 있습니다. 형광 활성화 세포 분류와 같은 기존 방법에 비해 면역 자기 세포 분류를 사용하는 이 기술의 주요 장점은 부드럽고, 높은 수율과 생존력으로 인간 1차 근육 세포를 탁월하게 분류할 수 있으며, 빠르게 수행할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 노화에서 관찰되는 섬유 지방 근육 퇴행의 세포 기초에 대한 우리의 이해를 높이는 방향으로 확장되며, 생검을 얻은 후 가능한 한 빨리 근육 유래 전구 세포를 분리하기 위해 여러 근육 병리학에서 확장됩니다. 먼저 조직 샘플의 무게를 결정한 다음 기저 매체에서 근육을 여러 번 부풀어 올려 샘플에서 과도한 혈액을 씻어냅니다. 근육이 실온에서 30-60초 동안 침전되도록 한 다음 튜브에서 마지막 2-3밀리리터의 배지를 제외한 모든 것을 흡인합니다.

다음으로, 튜브를 멸균된 페트리 접시에 뒤집어 남은 액체가 근육을 접시로 운반할 수 있도록 합니다. 이제 명백한 지방 또는 결합 조직의 눈에 보이는 조각이 있는지 샘플을 청소하십시오. 그런 다음 접시를 회전시켜 남은 매체를 동원한 다음 모든 매체를 흡인하고 조직 100-400mg당 1개의 콜라겐 분해 효소 및 디스 효소 용액 3밀리리터를 추가하고 근육 샘플을 매우 작은 1-2mm 입방체 조각으로 자릅니다.

샘플이 충분히 다진 경우. 넓은 멧돼지 25ml 피펫을 사용하여 조직 조각과 효소 용액을 멸균된 10-20ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 추가로 3ml의 효소 용액으로 플레이트를 세척한 다음 10ml 피펫을 사용하여 남아 있는 근육 조각을 튜브로 옮깁니다.

튜브를 섭씨 37도에서 60분 동안 놓습니다. 10ml 피펫으로 15분마다 조직 현탁액을 재충전합니다. 그런 다음 적어도 동등한 양의 신선한 재가열된 성장 배지로 효소 해리를 종료합니다.

다음으로, 100마이크로미터 필터에 셀 현탁액을 통과시켜 큰 파편을 제거한 다음 세포 재생을 원심분리합니다. 펠릿을 7-8 밀리리터의 성장 배지에 현탁시킨 다음 코팅되지 않은 T 25 조직 배양 플라스크에서 세포를 배양합니다. 섭씨 37도, 7일 동안 5%의 이산화탄소

주말에 트립신은 3분 동안 세포 단층을 주시합니다. 세포가 분리되면 5-10ml의 골격근 성장을 추가하고, 과잉 소화를 방지하기 위해 중간을 추가하고 원심분리로 세포를 펠렛화합니다. 그런 다음 계수 후 세포 계통 마커 특성화를 위해 일부 세포를 예약하고 나머지 세포를 15ml의 PBS 원심분리기 게인으로 세척합니다.

이번에는 펠릿을 170마이크로리터의 실온, 최대 분류 버퍼, 피펫에 다시 부유시켜 부드럽게 소생시킵니다. 35 마이크로리터의 잘 혼합된 anti CD 56 항체 접합 자성 마이크로 비드에서 세포를 현탁시킵니다. 세포 용액을 피펫으로 몇 번 혼합하고 부드러운 식물과 함께 섭씨 4도에서 15 분 동안 혼합물을 배양합니다.

배양 후 중간 지점에서 세포와 비드 용액을 10ml의 분류 완충액 원심분리기와 reus로 세척합니다. 펠릿을 1ml의 새로운 분류 버퍼에 현탁시킵니다. 다음으로, pres 분리 필터와 컬럼을 500마이크로리터의 소싱 버퍼로 윤활합니다.

그리고 그 때 즉각 pres 별거 여과기를 통해서 그리고 란으로 세포 현탁액의 전체 1 밀리리터를 섞고 옮기고, 소량의 성장 매체를 포함하는 메마른 50 밀리리터 원뿔 관으로 란을 통과해, 비 보유 섬유아세포 조각을 모으는 sourcing 완충기 힘 세척의 1 밀리리터로 란을 3 번 헹굽니다. 그런 다음 자석에서 컬럼을 제거하고 플런저를 컬럼 상단으로 눌러 CD 56 양성 세포 분획을 수집합니다. 따뜻한 성장을 포함하는 별도의 50ml 원추형 튜브에서 이 단계에서 중간 성장 배지가 방출됩니다.

이중 분류를 수행해야 하는 경우 수집된 양수 및 음수 세포 분획을 고려하십시오. 추가 순도를 위해 이중 소싱이 필요한 경우, 1차 분류에서 CD 56 포지티브 콜렉션 튜브에 배지를 배치하지 말고 적절한 실험 종말점에서 필터 및 컬럼 윤활부터 시작하는 단계를 반복합니다. CD 56 양성 세포 배양액을 배양 배지에 고정하고 동일한 양의 얼음처럼 차가운 8% 파라 포름알데히드를 사용합니다.

10분은 온화한 초목과 함께합니다. 그런 다음 고정제를 흡인하고 PBS로 세포를 두 번 세척하여 세포 표면 항원을 면역 염색합니다. PBS의 1%BSA에서 최소 1시간 동안 세포를 차단한 다음 해당 세포에 관련 1차 항체 및 2차 항체를 표시합니다.

검출기를 최적화하고, 현미경 및 염색과 관련된 레이저 출력 및 노출 설정을 얻습니다. 이미징하기 전에 세포는 원하는 수의 검출 채널과 6개 이상의 서로 다른 시야에서 세포의 이미지를 촬영합니다. 분석을 위해 적절한 TIFF 이미지 파일을 열고 이미지를 서로 드래그하여 적절한 해당 채널을 오버레이합니다.

각 채널은 레이어 패널에 별도의 레이어로 나타납니다. 그런 다음 분석 창에서 데이터 포인트 선택을 선택한 다음 사용자 지정을 선택하고 원하는 측정값을 선택합니다. 핵 형광 강도를 분석하려면 색상 범위 대화 상자를 열고 드롭다운 메뉴에서 샘플링된 색상을 선택합니다.

그런 다음 Shift 키를 누른 상태에서 레이블이 지정된 핵에 특정한 톤을 선택합니다. 저장을 클릭하여 동일한 세션에서 선택한 다른 이미지와 함께 사용할 수 있도록 이 색상 범위 선택 마스크를 저장합니다. 핵이 선택되면 click을 쓰고 fill을 선택합니다.

그런 다음 드롭다운 메뉴에서 검은색을 선택하고 불투명도가 100%로 설정되어 있는지 확인합니다.그런 다음 선택 및 반전을 클릭합니다. 그런 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 채우기를 다시 선택하고 드롭다운 메뉴에서 흰색 채우기를 선택합니다. 유역 알고리즘을 수행하여 현재 이진 핵층에서 부분적으로 겹치는 핵을 분리합니다.

선택한 다음 색상 범위를 선택한 다음 그림자를 선택하여 분리된 개별 핵을 선택합니다. 그런 다음 원하는 마커의 16비트 그레이 스케일 이미지가 포함된 레이어로 선택 영역을 전송하고 측정값 기록을 클릭합니다. 마지막으로, 선택한 측정값을 추가 오일 처리를 위해 적절한 분석 소프트웨어에 텍스트 파일로 내보냅니다.

지방생성 및 근육생성 계통 마커에 대한 면역 염색과 함께 정제된 세포 집단을 적색 염색하면 섬유아세포 분획만이 육안으로 볼 수 있는 섬유아세포에 의한 다량의 지방 축적과 함께 후성적 분화가 가능함을 보여주며, 치료 15일째까지 이러한 세포에 의한 핵 PPAR 감마의 강력한 발현에 의한 완전한 변형을 추가로 입증합니다. 이 세포는 기질에 남아 있는 TE 7 A 결합 조직 항원을 방출합니다. 대조적으로, 근육 세포는 핵 PPAR 감마 발현의 상향 조절 없이 desmin 및 myosin heavy chain의 발현을 포함하여 정상적인 표현형을 유지합니다. 이 그림에서는 Desmond 양성 근육 세포 필드의 정량적 분석과 이러한 데이터를 얻은 필드가 이 특정 시딩 밀도 및 시점에서 개별 핵의 근육 발현 변화를 보여주는 것으로 표시됩니다.

이 그래프에서는 세포 수준별로 세포의 서로 다른 세포 유형에서 전사 인자 수준을 직접 비교하는 방법의 유용성이 입증되었습니다. 예를 들어, 이러한 CD 56 음성 근육 섬유아세포는 높은 수준의 핵 지방생성 전사 인자인 PPAR 감마를 발현하는 반면, 분류된 CD 56 양성 근육 세포는 지방 세포 유도 배지에 노출된 후 매우 낮은 수준의 핵 수용체 전사 인자만 유지합니다. 이 기술을 통해 근육 생물학 분야의 연구자들은 건강하거나 병리학적인 인간 근육 샘플에서 세포 운명 결정 메커니즘을 탐구할 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 첫째, 정제되고 잘 특성화된 인간 근육 유래 세포를 높은 수율로 얻는 방법과 둘째, 면역형광 염색으로 식별된 세포 성분에 대한 객관적인 정량 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.